实时荧光定量PCR（RT-PCR）及细胞增殖实验操作

选择管家基因GAPDH作为内参基因，以H69作为对照组，检测四种亚型标志物ASCL1、NEUROD1、YAP1、POU2F3在H69、H446、H526、DMS114细胞系中的相对表达量。并根据实验得到的CT值，采用2^-^△△^CT法计算相对表达量。

本实验所用引物如下：

表1 引物序列

本研究应用10 μL的PCR反应体系。

（1）将试剂解冻，上下颠倒混匀（勿剧烈摇动）后置于冰上。

（2）将引物工作液解冻，混合均匀后置于冰上，DEPC水也置于冰上。

（3）冰上配制PCR反应混合液。

表 RT-qPCR反应试剂

（4）将PCR混合液混匀，不要涡旋，吸取9 L至反应管内，随后加入1 μL cDNA模板，阴性对照不加cDNA模板，用移液枪小心混匀。

（5）加样结束后，八连管封盖，并将反应管内的气泡甩掉，收集反应液于管底。

（6）设置PCR反应程序。

定量PCR反应程序

（7）将8连管或PCR 96孔板放入仪器开始反应。

CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的H69、H446、H526、DMS114细胞，其中H446、H69、H526以1×10⁴个细胞/孔的细胞密度接种于 96 孔板中，DMS114以4×10³个细胞/孔的细胞密度接种于 96 孔板中。待细胞融合率约80%，加入不同浓度西达本胺。每组均设置DMSO对照组及空白组（仅有同体积培养基）。H446加药浓度梯度为 0、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L，H69加药浓度梯度为0、2.5、5、10、20、40 μmol/L，H526加药浓度梯度为0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L，DMS114加药浓度梯度为0、1、2、4、8、16、32、64 μmol/L（加药浓度梯度根据细胞类型、前期预实验结果及细胞对药物的敏感程度而定）。每种浓度设6个复孔，每孔总体积为100 μL，培养24、48、72、96、120 h后检测细胞活力。每孔加入10 μL的CCK-8（避光），培养箱中孵育2-4 h后取出，使用酶标仪测定波长为450 nm的吸光度（OD值）。利用公式：抑制率=（加药组－空白组）/（对照组－空白组）计算增殖抑制率。实验重复3次，取平均值。以药物浓度为横坐标，细胞增殖抑制率为纵坐标绘图，使用SPSS23.0计算IC10、IC20、IC50，取平均值作为后续实验药物浓度。