主题:【第十六届原创】QuEChERS-UPLC-MS/MS 测定动物源性食品中18种β-受体激动剂残留

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摘要:建立了猪肉、猪肝等动物源性食品中18种β-受体激动剂残留的QuEChERS-UPLC-MS/MS检测方法。样品中的β-受体激动剂用β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶酶解、高氯酸沉淀蛋白、离心后上清液经过乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取,采用QuEChERS法净化,Inspire PFP色谱柱分离,正离子多反应监测模式检测(MRM),内标法定量。该方法18种受体激动剂在1 ng/mL~50 ng/ml范围内线性关系良好(R2>0.99)。方法检出限和定量限分别为 0.2 μg/kg、0.5 μg/kg,加标回收率在72%~118%之间,相对标准偏差为4.28%~10.38%。该方法前处理简单、净化效果好、灵敏度高。可用于动物源性食品中β-受体激动剂残留检测。

关键词:β-受体激动剂;QuEChERS;超高效液相色谱-串联质谱法;猪肉;猪肝

目前β-受体激动剂的检测方法主要有LC-MS 1,2GC-MS3,4和ELISA5,6。ELISA法操作简单、特异性强适合高通量快速分析,但通常检测种类有限,可能存在假阳性。GC-MS法可以用于多残留检测但是前处理过程需要衍生化,步骤相对复杂。LC-MS是目前检测 β-受体激动剂最常用的方法。样品前处理通常采用固相萃取(SPE)方法,需淋洗、洗脱等过程,本研究采用新型除脂聚合物材料,结合QuEChERS净化原理,建立了一种简单、快速、准确测定动物源性食品中β-受体激动剂残留的方法。

1.仪器设备及试剂耗材

1.1 仪器设备

1.1.1 AB SCIEX 4000+型超高效液相色谱-质谱联用仪(AB公司)

1.1.2 HSC-24B氮吹仪(天津恒奥科技发展有限公司);

1.1.3 GT10-1型高速离心机(北京时代北利);

1.1.4 Vortex-5型旋涡混合器(其林贝尔仪器)

1.2试剂耗材

1.2.1甲醇(色谱纯,迪马科技);

1.2.2乙腈(色谱纯, 迪马科技);

1.2.3叔丁基甲醚(色谱纯, 迪马科技);

1.2.4甲酸(色谱纯,迪马科技);

1.2.5乙酸铵(色谱纯,迪马科技);

1.2.6葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶(Merck公司)

1.2.7 Inspire PFP液相色谱100×2.1 mm,3 μm,迪马科技);

1.2.8 ProElut QUE净化管(2 mL,迪马科技)。

1.3标准溶液

1.3.1标准储备液:18种β-受体激动剂混合标准溶液(100 μg/mL,溶剂甲醇,迪马科技)

1.3.2内标储备液:精密称取适量克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D6、沙丁胺醇-D3、西马特罗-D7、齐帕特罗-D7、氯丙那林-D7、特布他林-D9、西布特罗-D9、盐酸马布特罗-D9、盐酸班布特罗-D9、克仑丙罗-D7、盐酸妥布特罗-D9、羟甲基克仑特罗-D6,用甲醇溶解并定容,配制成浓度为10 μg/mL内标储备液。4℃保存,有效期6个月。

1.3.3 标准工作液:准确吸取适量混标储备液,用甲醇稀释并定容,配制成浓度为0.1 μg/mL标准工作液。

1.3.4 内标工作液:准确吸取适量内标储备液,用甲醇稀释并定容,配制成浓度为0.1 μg/mL内标工作液。4℃保存,有效期6个月。

2、样品提取

准确称取样品2.0 g于离心管中,加6 mL 0.2 mol/L乙酸铵缓冲液、40 μLβ-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶,涡旋混匀,37℃避光水浴16 h,加100 μL 0.1 μg/mL内标工作液,涡旋混匀,8000 rmp离心8 min,取出上清。向下层残渣加5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液,涡旋5 min, 8000 rmp离心8 min,取上清与前一步上清混匀,高氯酸调pH值至1.0±0.2,8000 rmp离心8 min,取出上清,将上清液用10 mol/L NaOH溶液调pH至10.0±0.5。加乙酸乙酯15 mL,涡旋5 min, 5000 rmp离心5 min,取上层有机相。下层水相中再加入10 mL叔丁基甲醚,涡旋5 min, 5000 rmp离心5 min,取上层有机相。合并两次有机相,混匀,50℃水浴氮吹至干,用0.5 mL甲醇溶解残渣,再加入0.5 mL0.1%甲酸水定容到1 mL,混匀,待净化。

3、样品净化

将待净化液全部转移到ProElut QUE净化管中(内含PLS-A净化材料),涡旋2 min, 8000 rmp离心2 min,上清液过尼龙膜,待分析。

4、仪器条件

色谱条件 色谱柱:Inspire PFP,100×2.1 mm,3 μm;流速:0.3 mL/min;进样量:5 μ L;柱温:35 ℃; 流动相A为0.1%甲酸水溶液,B为0.1%甲酸乙腈,梯度洗脱程序:0~2 min,95% A;2~12 min,95% A~40% A;12~15 min,10% A;15~20 min,95% A。质谱条件 离子源:ESI(+);扫描方式:正离子扫描;检测模式:多反应监测;电喷雾电压:5500 V;雾化气压力:50 psi;辅助气压力:50 psi;气帘气压力:20 psi;离子源温度:500 ℃。定性离子 、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见表1。18种β-受体激动剂和13种内标典型色谱图见图1。

5、结果

猪肉和猪肝中18β-受体激动剂在1 ng/mL~50 ng/ml范围内线性关系良好(R2>0.99)。方法检出限和定量限分别为 0.2 μg/kg、0.5 μg/kg,加标回收率在72%~118%之间,相对标准偏差为4.28%~10.38%。

6. 结论

本文基于超高效液相色谱-串联质谱技术建立了一种快速有效的猪肉、猪肝中18种β-受体激动剂残留检测方法,获得了满意的净化效果和检测灵敏度,回收率和定量限均满足残留分析的要求。
              表1  1种β-受体激动剂和13种内标的质谱条件信息表
            Tab. 1  MS parameters of 18 β-receptor blockers and 13 internal standard

目标物名称

定性离子对

定量离子对

DP

CE

(m/z)

(m/z)

(V)

(V)

(母离子/子离子)

(母离子/子离子)

  

克伦特罗

277.0/203.0

277.0/203.0

40

21

277.0/168.1

40

38

克伦特罗-D9

286.0/204.0

286.0/204.0

50

23

莱克多巴胺

302.2/164.1

302.2/164.1

40

23

302.2/107.1

40

51

莱克多巴胺-D6

308.1/168.1

308.1/168.1

40

23

沙丁胺醇

240.2/148.1

240.2/148.1

40

24

240.2/222.1

40

15

沙丁胺醇-D3

243.1/151.0

243.1/151.0

30

25

西马特罗

220.0/202.0

220.0/202.0

40

13

220.0/160.0

40

22

西马特罗-D7

227.2/161.1

227.2/161.1

40

23

齐帕特罗

262.1/185.0

262.1/185.0

40

32

262.1/202.1

40

25

齐帕特罗-D7

269.1/185.0

269.1/185.0

40

32

氯丙那林

214.0/154.1

214.0/154.1

40

23

214.0/118.0

40

34

氯丙那林-D7

221.0/155.0

221.0/155.0

40

23

特布他林

226.2/152.0

226.2/152.0

40

21

226.2/107.1

40

36

特布他林-D9

235.2/153.1

235.2/153.1

40

20

西布特罗

234.0/160.1

234.0/160.1

40

21

234.0/143.0

40

34

西布特罗-D9

243.2/161.1

243.2/161.1

40

21

马布特罗

311.1/237.2

311.1/237.2

40

24

311.1/202.1

40

40

马布特罗-D9

320.1/238.0

320.1/238.0

40

24

溴布特罗

367.0/293.0

367.0/293.0

40

24

367.0/349.2

40

17

班布特罗

368.2/294.1

368.2/294.1

40

26

368.2/72.2

40

37

班布特罗-D9

377.2/295.1

377.2/295.1

40

26

克仑丙罗

263.1/245.1

263.1/245.1

40

15

263.1/203.0

40

24

克仑丙罗-D7

270.0/204.0

270.0/204.0

40

25

妥布特罗

228.0/154.0

228.0/154.0

40

21

228.0/118.0

40

35

妥布特罗-D9

237.0/155.0

237.0/155.0

40

21

利托君

288.1/121.1

288.1/121.1

45

29

288.1/150.1

45

25

克仑赛罗

319.1/203.0

319.1/203.0

50

26

319.1/132.0

50

39

马喷特罗

324.9/237.9

324.9/237.9

50

20

324.9/217.9

50

29

克仑潘特

291.0/203.0

291.0/203.0

30

21

291.0/132.1

30

38

羟甲基克仑特罗

293.0/203.0

293.0/203.0

30

23

293.0/132.1

30

28

羟甲基克仑特罗-D6

299.0/203.0

299.0/203.0

40

25



注:溴布特罗、马喷特罗采用克伦特罗同位素内标定量,利托君、克仑赛罗、克仑潘特采用莱克多巴胺同位素内标定量。


图1. (10 ng/mL)检测的总离子流图

Fig. 1 Total ion chromatogram of 18 β-receptor blockers (1 ng/mL) and 13 internal standard (10 ng/mL) mixed standard solution



参考文献

1. 李延山,刘庆伟,卞大伟等.ELISA检测猪尿中β-受体激动剂类药物影响因素研究[J].动物医学进展,2018,39(08):78-82.

2. Zhang Z Y, Su K, Wang R, et al. Determination of β-receptor agonist residue in pig urine by ELISA[J]. China Animal Health Inspection, 2019, 36(5): 103-109.

3. 刘晓晶,张媛媛,刘彤彤等.固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定熟肝制品中7种β-受体激动剂[J].化学分析计量,2023,32(04):63-68.

4. 曹忠波,曹歌,张媛媛等.同位素稀释-气相色谱-串联质谱法测定熟肉中多组分β-受体激动剂[J].食品安全质量检测学报,2020,11(24):9140-9146.

5. 崔利辉,李璐琦,李国秀等.超高效液相色谱-串联质谱法测定牛肉中9种β-受体激动剂[J].食品安全质量检测学报,2021,12(12):4858-4866.

6. Fan S, Zhang N, Liu P, et al. Determination of 20 kinds of β-receptor blockers in animal foods by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Wei Sheng yan jiu= Journal of Hygiene Research, 2020, 49(5): 829-867.
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