主题：【第十七届原创】离子色谱法同时测定药品中巴比妥酸和5种无机阴离子的研究

离子色谱法同时测定药品中巴比妥酸和5种无机阴离子的研究

黄选忠

（湖北兴山县疾病预防控制中心，湖北兴山,443700）

摘要　建立离子色谱-抑制电导检测法同时测定巴比妥酸和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等5种无机阴离子的新方法。以SH-AP-2型阴离子交换柱为分离柱，以6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液为淋洗液，流量为0.80 mL/min，采用等度洗脱的方式可将巴比妥酸与F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等5种常见无机阴离子完全分离，巴比妥酸和SO₄^2-，NO₃^-、Cl^-和H₂PO₄^-，F^-的峰面积与其质量浓度分别在0.10～20.0mg/L、0.05～10.0mg/L和0.04～8.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r在0.9994～0.9999，方法应用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等药品中巴比妥酸和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等无机阴离子的同时测定，加标回收率在92.6%～104.0%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）在1.06%～3.89%，最低检出限在0.01mg/L～0.06mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中巴比妥酸和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等无机阴离子的定量分析。

关键词　离子色谱法；巴比妥酸；无机阴离子；巴比妥；苯巴比妥；维生素B₁₂

中图分类号：O652.63  文献标识码：      文章编号：

Ion chromatography for the simultaneous determination of barbituric acid

and five inorganic anions in pharmaceutical products

HUANG Xuanzhong

(Prevention and Health Protection Centre of Hubei Xingshan County，HubeiXingshan　443700， China)

A new method for the simultaneous determination of barbituric acid and F^-, Cl^-, NO₃^-, H₂PO₄^- and SO₄^2- by ion chromatography-suppressed conductivity detection was established. With SH-AP-2 anion exchange column as the separation column and 6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃ solution as the eluent, the flow rate was 0.80 mL/min, barbituric acid and five common inorganic anions such as F^-, Cl^-, NO₃^-, H₂PO₄^- and SO₄^2- were completely separated by isocratic elution, The peak area of barbituric acid and SO₄^2- , NO₃^-, Cl^- and H₂PO₄^-, F^- showed a good linear relationship with their mass concentrations in the range of 0.10～20.0mg/L, 0.05～10.0mg/L and 0.04～8.0mg/L , and the correlation coefficient r was 0.9994～0.9999, respectively.The method was applied to the simultaneous determination of barbituric acid and inorganic anions such as F^-, Cl^-, NO₃^-, H₂PO₄^- and SO₄^2- in barbiturates, phenobarbital and vitaminB₁₂ drugs, with a recovery rate of  92.6%～104.0%, a relative standard deviation (RSD) of 5 parallel measurement results of 1.06%～3.89%, and the minimum detection limit was 0.01mg/L～0.06mg/L. It can be used for the quantitative analysis of barbituric acid and inorganic anions such as F^-, Cl^-, NO₃^-, H₂PO₄^- and SO₄^2- in samples such as barbiturates, phenobarbital and vitaminB₁₂.

Key words  ion chromatography；barbituric acid；Inorganic anions；barbiturates；phenobarbital；vitaminB₁₂

巴比妥酸（BA）是合成巴比妥、苯巴比妥等镇静催眠药和维生素B₁₂等药品的中间体^[1]，在这些合成药品中可能残留有微量的BA而影响品质，F^-、NO₃^-、H₂PO₄^-等无机阴离子过量摄入会影响人体健康，因此监测巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等药品中微量BA和F^-、NO₃^-、H₂PO₄^-等无机阴离子含量对保障用药安全具有重要意义。目前测定药品中微量BA的方法已报道的有化学发光法^[2]和分光光度法^[3],其中,化学发光法需要专用仪器,而分光光度法则灵敏度偏低。离子色谱法目前已成为测定无机阴离子的常用方法，已广泛应用于药品中无机阴离子的同时测定^[4-10]。本实验研究用SH-AP-2型阴离子交换柱和CIC-100型色谱仪同时测定巴比妥等药品中的BA和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等5种无机阴离子的色谱条件和可行性，结果表明，以SH-AP-2型阴离子交换柱为分离柱、6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液为淋洗液，流量为0.80ml/min,采用等度洗脱的方式可使BA和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等5种无机阴离子完全分离，且BA和SO₄^2-，NO₃^-、Cl^-和H₂PO₄^-，F^-的峰面积与其质量浓度分别在0.10～20.0mg/L、0.05～10.0mg/L和0.04～8.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r≥0.9994，方法应用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的同时测定， 加标回收率分别为99.2%～100.9%、101.0%～103.8%、96.1%～103.0%、92.6%～104.0%、94.6%～101.9%和98.6%～101.0%，5次平行测定结果的RSD分别为1.23%～2.38%、1.15%～1.89%、1.06%～2.11%、1.11%～3.89%、2.05%～3.66%和1.09%～3.05%，按3倍信噪比（3N/b）计,最低检出限在0.01mg/L～0.06mg/L,方法适用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的同时测定。

1　实验部分

1.1　主要仪器与试剂

离子色谱仪：CIC-100，青岛盛瀚色谱公司。抑制器：SHY-2型自再生抑制器,青岛盛瀚色谱公司。

定量环体积：25μL；自动进样器：SHA—15型，青岛盛瀚色谱公司。0.45μm滤膜过滤器：13 mm，青岛盛瀚色谱公司。

巴比妥酸（C₄H₄N₂O₃·2H₂O）：分析纯（（含量≥98.5%）），国药集团化学试剂有限公司。

    BA标准溶液：1000mg/L，称取0.1301g巴比妥酸，溶解于高纯水,定容至100ml容量瓶。

    磷酸二氢钾、溴化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

    H₂PO₄^-和Br^-标准溶液：1000 mg/L，按照文献[11]配制。

    NO₃^-、F^-、Cl^-、SO₄^2-标准溶液：质量浓度均为1000 mg/L，编号分别为GBW(E)080264、GBW(E)080549、GBW(E)080268、GBW(E)080266；NO₂^-标准溶液：质量浓度为100 mg/L，编号为GBW(E)080223，北京中国计量科学研究院。

无水碳酸钠、碳酸氢钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验所用其它试剂均为AR级。

实验用水为高纯水（电阻率为18.2ΜΩ·cm）。

1.2　仪器工作条件

色谱分离柱：SH-AP-2型阴离子交换柱（250×4.0mm  i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：2004005）；保护柱：SH-AP-2型保护柱（50×4.0mm  i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：G200023）。淋洗液:6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液，流量为0.80ml/min；柱箱温度：35℃；电流：75mA；检测器：电导检测器；自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之间），置换量70μL，取样量25μL，扎针深度4mm。

1.3　实验方法

1.3.1　标准溶液配制

    BA和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-混合标准应用液：临用前将各种标准溶液逐级稀释成含5.0mg/L的BA和SO₄^2-、2.50mg/L的Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和2.0mg/L的F^-（A液）和50.0mg/L的BA和SO₄^2-、25.0mg/L的Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和20.0mg/L的F^-（B液）标准应用液。

取上述混合标准应用液A液0.20、1.00mL及B液0.20、0.40、1.0、2.0、4.0mL于7只10mL容量瓶中加纯水至刻度，混匀，配制成含BA和SO₄^2-均为0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00mg/L，含Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-均为0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00mg/L和含F^-为0.04、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00mg/L的系列标准工作溶液。

1.3.2标准曲线绘制

    取1.3.1制备的系列标准工作溶液，各管1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样，分别测定各组分的峰面积，以各组分的峰面积(y)为纵坐标，以色谱峰面积对应的组分质量浓度(x)为横坐标，绘制工作曲线。

1.3.3 样品处理

称取巴比妥0.250g加5mL无水乙醇溶解后,用高纯水定容至100ml,取该样液用高纯水稀释1倍并经0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中巴比妥的质量浓度为1250mg/L。

取苯巴比妥片（30mg苯巴比妥/片）5片研碎加10mL无水乙醇充分研磨溶解后,用高纯水定容至100ml,滤去不溶物，滤液用高纯水稀释1倍并经0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中苯巴比妥的质量浓度为750mg/L。

取维生素B₁₂片40片（含维生素B₁₂约1000μg）用高纯水洗去表面糖衣后，加高纯水充分研磨溶解并定容至100ml,滤去不溶物，滤液用0.45μm滤膜过滤后供测试,样品测试液中维生素B₁₂的质量浓度为10mg/L。

1.3.4样品测定

取1.3.3的样品测试液1.5ml于样品瓶中，启动自动进样器进样测定各组分的峰面积，以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。

2　结果与讨论

2.1　色谱条件的选择

2.1.1　淋洗液的选择

试验分别以5.0mmol/L、6.0mmol/L、8.0mmol/L和10.0mmol/LNa₂CO₃溶液为淋洗液，考察了SH-AP-2型柱对BA和F^-、Cl^-、NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-等常见阴离子的分离情况，结果表明，当Na₂CO₃溶液超过6.0mmol/L时，H₂PO₄^-和SO₄^2-二者合并为一个峰，这与文献^[12]报道的情况相似，因此要将前述6种组分完全分离，不宜以单纯Na₂CO₃溶液为淋洗液，应以Na₂CO₃/NaHCO₃混合溶液为淋洗液， Na₂CO₃与NaHCO₃溶液浓度配比试验结果见表1，从表1可见，随着淋洗液中NaHCO₃浓度的增加,NO₃^-的峰分离度（R）逐渐降低,BA的峰分离度则无明显的改变,而F^-、Cl^-和H₂PO₄^-的峰分离度逐渐增加,为使NO₃^-与H₂PO₄^-均有适宜的峰分离度,本试验以6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液为淋洗液，在此淋洗条件下F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的分离色谱图见图1。

表1 Na₂CO₃与NaHCO₃不同配比对各组分峰分离度（R）的影响（流量0.80 ml/min，柱箱温度35℃）

组分	Na2CO3+NaHCO3（mmol/L）
	6.0+0	6.0+0.9	6.0+1.0	6.0+1.1	6.0+2	6.0+3.0
F-	2.90	3.05	3.06	3.07	3.15	3.36
Cl-	5.74	6.05	6.06	6.07	6.45	6.63
NO3-	2.02	1.61	1.53	1.54	1.27	1.08
BA	3.97	3.75	3.57	3.48	3.55	3.16
H2PO4	二者合并为一个峰	1.47	1.63	1.62	2.27	2.88
SO42-		/	/	/	/	/

2.1.2　淋洗液流量的影响

考察了淋洗液流量分别为0.70、0.80和0.90 mL/min时各组分的分离情况，试验结果见表2，从表2

图1 F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-分离效果图

可见，随着淋洗液流量的升高，各组分的保留时间（T)逐渐缩短，峰分离度（R）逐渐减小（NO₃^-和H₂PO₄^-除外），

表2  淋洗液流量的影响（6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液，柱箱温度35℃）

组分	0.70ml/min			0.80ml/min			0.90ml/min
	T/min	R	峰面积	T/min	R	峰面积	T/min	R	峰面积
F-	5.955	3.19	836046	5.212	3.08	735031	4.666	3.02	672656
Cl-	8.155	6.33	883680	7.137	6.14	775756	6.397	6.05	695800
NO3-	12.156	1.43	940957	10.633	1.52	854040	9.536	1.38	730092
BA	13.299	3.60	521413	11.657	3.55	456506	10.440	3.53	403955
H2PO4	16.672	1.89	385185	14.578	1.67	311122	13.066	1.83	300895
SO42-	18.392	/	1314478	16.036	/	1151063	14.388	/	1016420

峰面积逐渐降低,为使组分有较短的保留时间、较高的峰分离度（≧1.5）和检测灵敏度、系统有较低的压力，综合考虑，本试验确定的淋洗液流量为0.80mL/min。

2.1.3　柱箱温度的选择

考察了柱箱温度为30℃、35℃、40℃时各组分的分离效果，结果见表3，从表3可见，随着柱温的升高，Cl^-、NO₃^-和BA的T稍微缩短，而F^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-的T则稍微延长，各组分峰面积逐渐增加（BA除外），BA和H₂PO₄^-的R逐渐增加，而F^-、Cl^-先降后增，NO₃^-则反之，综合考虑待测组分的检测灵敏度和峰分离度，本试验选择的柱箱温度为35℃。

表3  柱箱温度选择试验结果（6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液，流量0.80 ml/min）

组分	30℃			35℃			40℃
	T/min	R	峰面积	T/min	R	峰面积	T/min	R	峰面积
F-	5.207	3.02	739319	5.218	2.88	794144	5.239	2.96	863877
Cl-	7.184	5.97	730106	7.162	5.79	754818	7.087	5.82	850656
NO3-	10.757	1.47	816408	10.611	1.51	841047	10.426	1.48	904089
BA	11.905	3.00	451962	11.705	3.40	452106	11.416	3.84	440461
H2PO4	14.447	1.43	273433	14.537	1.64	318123	14.586	1.85	367593
SO42-	15.517	/	1018577	15.793	/	1142753	16.108	/	1237767

2.2　共存物质的影响

    分别取1.1所列各种标准溶液配制成含12mg/L的BA、4mg/L的NO₃^-、H₂PO₄^-和SO₄^2-、1mg/L的F^-、2mg/L的Cl^-、5mg/L的NO₂^-和Br^-的混合标准溶液，以考察NO₂^-和Br^-与6种待测组分的分离效果，见图2，从图2可知，在本试验条件下，NO₂^-和Br^-与硝6种待测组分可以完全分离，均不影响 F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-等组分的测定。

图2　BA与常见阴离子色谱图

2.3　线性方程、线性范围与检出限

按照1.3.1配制标准系列，测定 F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-等组分的峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，以其质量浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，进行线性回归。测定仪器30min的基线噪声，以3倍基线噪声除以标准曲线的斜率（3N/b）计算各组分的最低检出限。其标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数r（回归方程的截距、斜率和r均由仪器软件自动生成）、检出限列于表4。从表4可见，BA和SO₄^2-，NO₃^-、Cl^-和H₂PO₄^-，F^-的峰面积与其质量浓度分别在0.10～20.0mg/L、0.05～10.0mg/L和0.04～8.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r在0.9994～0.9999，检出限分别为0.01mg/L～0.06mg/L。其中，2.0mg/L的BA和SO₄^2-、1.0mg/L的NO₃^-、Cl^-和H₂PO₄^-和0.80mg/L的F^-的标准色谱图见图3。

表4　BA等6种组分的线性范围、回归方程、相关系数和检出限

组分	线性范围/mg/L	回归方程	相关系数/r	检出限/mg/L
F-	0.04～0.80	S=608900C+172700	0.9999	0.01
Cl-	0.05～10.0	S=369700C-7110	0.9999	0.01
NO3-	0.05～10.0	S=101100C+2467	0.9999	0.02
BA	0.10～20.0	S=34990C-2426	0.9999	0.06
H2PO4-	0.05～10.0	S=83140C-2426	0.9994	0.03
SO42-	0.10～20.0	S=270800C-9792	0.9998	0.01

图3　 F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的标准色谱图

2.4　样品测定及加标回收试验

按1.3.3和1.3.4的步骤操作，测定巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中的 F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的含量。并在3种样中分别添加混合标准应用液（B液）0.20、0.40和2.00mL配制成加标样品，各平行测定5次，计算加标回收率及测定结果的相对标准偏差（RSD），结果见表5。由表5可知， F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的加标回收率分别为99.2%～100.9%、101.0%～103.8%、96.1%～103.0%、92.6%～104.0%、94.6%～101.9%和98.6%～101.0%，5次平行测定结果的RSD分别为1.23%～2.38%、1.15%～1.89%、1.06%～2.11%、1.11%～3.89%、2.05%～3.66%和1.09%～3.05%，方法的回收率较高、重现性良好，巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂加标样品色谱图见图4。

                         

图4　巴比妥（A）、苯巴比妥（B）和维生素B₁₂（C）加标样品色谱图

表5 巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂样品测定及加标回收试验结果

组分	巴比妥（1250mg/L）				苯巴比妥（750mg/L）				维生素B12（10mg/L）
	本底/mg/L	加入量/mg/L	回收率/%	RSD/%	本底/mg/L	加入量/mg/L	回收率/%	RSD/%	本底/mg/L	加入量/mg/L	回收率/%	RSD/%
F-	<0.01	0.40	100.9	2.38	0.091	0.80	99.2	1.23	<0.01	4.00	99.5	1.26
Cl-	0.138	0.50	101.0	1.15	2.37	1.00	103.8	1.89	2.23	5.00	101.5	1.55
NO3-	0.024	0.50	103.0	2.11	0.521	1.00	96.1	1.68	1.08	5.00	100.6	1.06
BA	<0.06	1.00	92.6	1.11	<0.06	2.00	94.1	3.89	<0.06	10.00	104.0	2.27
H2PO4-	<0.03	0.50	101.9	2.37	<0.03	1.00	94.6	3.66	0.182	5.00	98.3	2.05
SO42-	0.258	1.00	101.0	2.52	0.626	2.00	98.6	2.30	3.15	10.00	100.8	1.09

3　结语

建立了以SH-AP-2型阴离子交换柱为分离柱，以6.0mmol/LNa₂CO₃-1.0mmol/LNaHCO₃溶液为淋洗液，流量为0.80 mL/min等度洗脱，离子色谱-抑制电导检测法同时测定F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-的新方法。方法应用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中F^-、Cl^-、NO₃^-、BA、H₂PO₄^-和SO₄^2-同时的测定，加标回收率在92.6%～104.0%，5次平行测定结果的相对标准偏差（RSD）在1.06%～3.89%，最低检出限在0.01mg/L～0.06mg/L，方法回收率较高、重现性良好，操作简便快速，可用于巴比妥、苯巴比妥和维生素B₁₂等样品中BA等6种组分的定量分析。

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