主题：【原创】超高效液相色谱串联质谱法检测水体中孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿的含量

超高效液相色谱串联质谱法检测水体中孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿的含量

摘要：研究建立应用超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定环境水体中痕量孔雀石绿（MG）及其代谢物隐性孔雀石绿（LMG）的方法。水样直接通过MCX固相萃取柱富集和净化，通过BEH C₁₈（1.7 μm，50mm×2.1mm）色谱柱分离，以含0. 1%甲酸的5 mmol /L 乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，采用电喷雾正离子模式，在多反应监测条件下采集质谱信号，外标法定量。结果表明：MG 和LMG在0.25～25μg/L浓度范围内成良好的线性关系，0.02、0.1、0.5 μg/L 3个浓度梯度的回收率为80.6%~92.7%，相对标准偏差为3.29%~8.23%。该方法简便、高效、准确，适用于检测水体中痕量的孔雀石绿（MG）和隐性孔雀石绿（LMG）。

关键词：超高效液相色谱串联质谱法 孔雀石绿 隐性孔雀石绿 水体

孔雀石绿(Malachite green，MG) 化学式为C₂₃H₂₅ N₂Cl，相对分子质量为364.92，曾在水产养殖中常用来预防和治疗受精卵和成鱼的水霉病、腮霉病和小瓜虫病等，以及用于活鱼运输、池塘暂养过程和环境的消毒^【1~2】。自从上世纪80年代发现孔雀石绿具有潜在的致癌性，美国、日本以及英国等许多国家已禁止其用于水产养殖业。我国农业行业标准NY5071—2002《无公害食品渔用药物使用准则》中已将孔雀石绿列为禁用药物。虽然MG 在水产养殖中的违禁使用情况越来越少，但由于其曾经被广泛应用，已对环境造成了严重污染，水产品中被查出含有MG 的事件也时有发生。水体中存在的痕量MG 有可能引起了水产品的二次污染^【3~5】，因此建立水体中MG及其代谢物LMG的检测方法是很有必要的。

1 实验部分

1.1 主要仪器设备和试剂

Acquity UPLC-XEVO TQ MS型超高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）；A120S型万分之一天平（德国Sartorius公司）；

孔雀石绿（MG）和隐性孔雀石绿（LMG）标准品均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；乙酸铵为优级纯（天津科密欧）；Oasis MCX固相萃取小柱( 美国Waters 公司，150 mg /6 mL)；实验用水为美国Milli － Q 去离子水发生器制备的高纯水。

1.2 标准溶液的制备

准确称取孔雀石绿( MG) 和隐性孔雀石绿( LMG)标准品适量，用乙腈溶解，配制成质量浓度为100μg/mL 的标准储备液，根据需要用流动相将混合中间标准溶液稀释成浓度为0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00μg/L的混合标准工作溶液，现用现配。

1.3 仪器分析条件

（1）液相色谱条件  色谱柱:Waters BEH C₁₈（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：乙腈；流动相B：含0. 1%甲酸的5 mmol /L 的乙酸铵水溶液。梯度洗脱程序：0~1.0min，10% A~60% A；1. 0~3. 0 min，60%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1min，100% A~10% A，4.1 ~5.0min 10% A。

（2）质谱条件  离子源：电喷雾离子源( ESI ⁺ ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。

表1 目标化合物的多反应监测（MRM）条件

名称	离子对	锥孔电压eV	碰撞电压eV
MG LMG	329.3＞207.9 329.3＞313.1﹡ 331.3＞239.1 331.3＞316.3﹡	29 29 38 38	46 44 42 25

1.4 样品处理

1.4.1 水样采集

分别从水面表层、水面下约0.5m 、水面下约1.5m处采集养殖区池塘水，水样采集后，混合均匀，24h内测定。

1.4.2 水样净化

准确量取25 mL待测水样，过0.45μm水系滤膜除去固体悬浮物后转入100 mL锥形瓶中，加入0.5mL甲酸使水样甲酸体积分数为1%，摇匀。将酸化后的水样全部通过已活化好的MCX 固相萃取小柱（使用前用5mL甲醇、5mL水活化），待水样全部过完后，依次用3mL 2%(V/V)甲酸、3mL水、3mL 甲醇淋洗，弃去淋洗液。真空抽干后，用5 mL乙酸乙酯－ 甲醇－ 氨水( 体积比为50：45：5) 洗脱进行洗脱，收集洗脱液于4 0℃条件下用氮气吹干，用初始流动相定容至1.0mL，过0.22μm有机系滤膜后，上机进行分析检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

MG 和LMG 属于三苯基甲烷类化合物，具有弱碱性，因此选择ESI 正离子模式，加入0.1%的甲酸有助于目标物离子化。色谱条件摸索中发现，只加入0.1%甲酸MG和LMG的保留时间非常接近（分别为1.34、1.42 min），加入5 mmol /L 的乙酸铵后，LMG保留时间延长为2.17 min，同时LMG离子响应强度也有所增强，因此本实验选用含0. 1%甲酸的5 mmol /L 乙酸铵水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱。

2.2方法的线性关系与检出限

按照1.2节标准溶液配制方法，配制系列不同浓度的混合标准溶液进行测定，取其峰面积(Y)与浓度(X)作线性回归，线性关系和相关系数见表2。在本法测定条件下，采用3 倍信噪比(S/N=3)计算水体中MG和LMG的检出限均为0.01μg/L。

表2 MG和LMG标准曲线的线性关系和相关系数

名称	线性范围μg/L	线性方程	相关系数r
MG LMG	0.25～25 0.25～25	Y ＝3581.3X ＋ 5.138 Y ＝2356.7X ＋ 8.365	0.9990 0.9993

2.3方法的回收率与精密度

    采用在空白样品中添加标准溶液的方法，在采集的水样中添加一定体积的标准溶液，使水样中MG和LMG含量分别达到0.02、0.1、0.5 μg/L 3 个浓度梯度，每个梯度进行6 次重复试验，按照本方法处理后进行测定。结果表明，MG和LMG 3个浓度梯度的回收率为80.6%~92.7%，相对标准偏差为3.29%~8.23%。因此，MG 和LMG 在水体中的加标回收率相对标准偏差均能达到检测要求，说明本方法具有较高的准确度和精密度。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱串联质谱法检测水体中孔雀石绿（MG）和隐性孔雀石绿（LMG）残留量的方法。该方法具有选择性高、步骤简单、分析快速的特点，检出限低、回收率高、精密度良好，可作为环境水体中痕量孔雀石绿（MG）和隐性孔雀石绿（LMG）残留量检测的参考方法。

参考文献

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