主题：【分享】连翘脂素靶向RhoA防止破骨细胞分化和骨质流失

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发表于：2024/09/12 22:02:45 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

连翘（F. suspensa）是中医临床常用的传统中药，因其解热和抗炎作用而在中医中用于治疗传染病，有清热、解毒、排脓、散肿等功效。最近的研究表明，F. suspensa水提取物（WFS）对抗破骨细胞异常分化和雌激素缺乏引起的骨质流失有益，且WFS的植物化学特征表明丰富的生物碱、木脂素、萜烯类、黄酮类和类固醇成分可能具有抗骨质疏松活性。在这些成分中，连翘脂素（Phi）是尚未在骨代谢中报道的成分之一。2024年2月15日，上海交通大学医学院附属瑞金医院/上海市创伤骨科研究所江敏、徐醒、奚小冰团队在Phytother Res（IF=7.2）上发表题为“Phillygenin prevents osteoclast differentiation and bone loss by targeting RhoA”的文章，发现连翘叶中富含的一种化合物连翘脂素（Phi）在体内外具有抗破骨细胞生成特性。机制上，Phi与RhoA结合可通过NF-κB/NFATc1/c-fos通路和RhoA/ROCK1/Cofilin通路在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收，研究可能为Phi和F. suspensa在功能性食品中开辟新的应用领域。

1、连翘脂素减轻体内LPS诱导的小鼠颅骨骨溶解作者通过脂多糖（LPS）诱导的小鼠颅骨骨溶解模型来说明Phi在体内的保护作用，发现Phi显著逆转LPS诱导的骨质破坏。此外，组织切片TRAP染色显示LPS显著增加破骨细胞（OC），而Phi则减少OC的形成，表明Phi抑制OC的形成，从而抑制体内骨质破坏。

2、Phi 可预防卵巢切除术（OVX）引起的体内骨质流失作者接着评估了Phi在OVX诱导的骨质疏松症小鼠模型中的作用，发现OVX小鼠表现出广泛的骨质疏松，而Phi使其得到改善。此外，对股骨切片也进行了TRAP和HE染色，结果显示OVX组的OCs数量增加，而Phi组的OCs数量减少。

3、Phi 抑制小鼠BMMs破骨细胞生成作者接着体外评估了Phi的作用，细胞增殖和细胞毒性实验显示Phi不干扰BMMs的增殖，且无细胞毒性，TRAP染色结果表明Phi以剂量依赖性方式抑制成熟OC的形成。随后以Phi干预OCs分化，发现Phi在早期、中期、晚期均不同程度抑制破骨细胞形成。

4、Phi通过OC分化和骨吸收相关基因表达损害骨吸收接下来，作者利用RNA-seq阐明 Phi 抑制OC分化的潜在分子机制，KEGG发现差异基因主要参与破骨细胞分化途径和肌动蛋白细胞骨架途径的调控等，GO显示骨吸收和骨重建的调控等骨重建过程，肌动蛋白细胞骨架组织过程显著富集。转录组结果和PCR验证均显示Phi处理后与破骨细胞分化相关的基因下调。

5、Phi与RhoA结合并抑制RhoA激活剂诱导的RhoA活性接着作者采用了Pulldown+MS的方法识别Phi的直接靶点。首先合成生物素化的探针，发现生物素标签不会影响Phi的活性，进一步开展pulldown+MS鉴定到155种蛋白质，PPI显示与细胞骨架相关的簇及RhoA蛋白的存在。已有报道表明RhoA对破骨细胞的生长、运动和骨吸收至关重要。作者采用免疫沉淀法进一步证实了Phi与RhoA的结合，分子对接预测了结合位点，进一步酶活实验发现Phi能够以剂量依赖性的方式抑制RhoA活性。

6、Phi通过RhoA/ROCK1/NFATc1通路发挥抑制作用NFATc1/c-fos已被证实是破骨细胞生成中最重要的转录因子，作者发现Phi抑制 NFATc1/c-fos 的mRNA和蛋白表达。TRAP染色结果显示C3（RhoA抑制剂）减少OC的形成，降低NFATc1的mRNA表达和蛋白表达，在破骨细胞生成中发挥了与Phi类似的作用。此外，敲低RhoA导致成熟OC数量减少，NFATc1蛋白表达也受到抑制。RhoA通过磷酸化ROCK1下游底物激活ROCK1，从而发挥重塑细胞骨架等作用，作者发现Phi通过RhoA/ROCK1/NFATc1通路发挥其抗破骨细胞生成作用。

7、Phi靶向RhoA/ROCK1减弱RANKL诱导的NF-κb磷酸化NF-κb信号通路是参与OC分化和吸收的关键信号通路，作者发现Phi显著抑制RANKL诱导的p65磷酸化和IκBα磷酸化。此外，C3（RhoA抑制）和Y-27632（ROCK1抑制剂）显著抑制NF-κB信号通路，与 Phi 的抑制作用一致。结果表明Phi显著抑制NF-κB信号通路，并且RhoA/ROCK1信号通路也可能参与其中。

8、Phi通过RhoA/ROCK1信号通路抑制OCs F-actin的形成破骨细胞中的关键骨骼蛋白F-actin聚合后形成F-肌动蛋白环，这对破骨细胞介导的骨吸收至关重要。RNA-seq结果也显示Phi抑制了肌动蛋白形成过程。作者使用TRITC鬼笔环肽染色发现Phi、C3和Y27632抑制了F-肌动蛋白环的形成，表明Phi和RhoA/ROCK参与了F-肌动蛋白环的形成。之前有报道称RhoA是Rho家族中调节ROCK1/cofilin通路以实现肌动蛋白丝分布的关键成员，WB结果显示在用Phi、C3或Y-27632处理后，ROCK1和p-cofilin/cofilin表达也降低。

总结该研究发现Phi与RhoA结合可通过NF-κB/NFATc1/c-fos通路和RhoA/ROCK1/Cofilin通路在体外抑制RANKL诱导的破骨细胞生成和骨吸收。此外，Phi显著降低LPS诱导的颅骨骨吸收，预防和缓解OVX诱导的体内骨质疏松症。

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