4.有关检测器的故障及其排除
1)流动池内有气泡
如果有气泡连续不断地通过流动池,将使噪音增大,如果气泡较大,则会在基线上出现许多线状“峰”,这是由于系统内有气泡,需要对流动相进行充分的除气,检查整个色谱系统是否漏气,再加大流量驱除系统内的气泡。如果气泡停留在流动池内,也可能使噪音增大,可采用突然增大流量的办法除去气泡(最好不连接色谱柱);或者启动输液泵的同时,用手指紧压流动池出口,使池内增压,然后放开。可反复操作数次,但要注意不使压力增加太多,以免流动池破裂。
2)流动池被污染
无论参比池或样品池被污染,都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池,要注意溶剂的互溶性;如果污染严重,就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗,或者取出池体进行清洗、更换窗口。
3)光源灯出现故障
紫外或荧光检测器的光源灯使用到极限或者不能正常工作时,可能产生严重噪音,基线漂移,出现平头峰等异常峰,甚至使基线不有回零。这时需要更换光源灯。
4)倒峰
倒峰的出现可能是检测器的极性接反了,改正后即可变成正峰。用示差折光检测器时,如果组分的折光指数低于流动相的折光指数,也会出现倒峰,这就需要选择合适的流动相。如果流动相中含有紫外吸收的杂质,使用紫外检测器时,无吸收的组分就会产生倒峰,因此必须用高纯度的溶剂作流动相。在死时间附近的尖锐峰往往是由于进样时的压力变化,或者由于样品溶剂与流动相不同所引起的。
5.流动相的滤过及贮存
所有溶剂使用前都必须经0.45µm(或0.22µm)滤过,以除去杂质微粒,色谱纯试剂也不例外(除非在标签上标明“已滤过”)。
用滤膜过滤时,特别要注意分清有机相(脂溶性)滤膜和水相(水溶性)滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂,过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液,严禁用于有机溶剂,否则滤膜会被溶解!溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相,可在混合前分别滤过,如需混合后滤过,首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内,不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂,导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统,可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变化,也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要贮存。如确需贮存,可在冰箱内冷藏,并在3天内使用,用前应重新滤过。容器应定期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用,所以盛甲醇的瓶子无此现象
6.仪器的使用:
(1)流动相滤过后,注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。
(2)柱在线时,增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行,一般不超过1ml/min,反之亦然。否则会使柱床下塌,叉峰。柱不线时,要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去(或下来),勿急升(降),以免泵损坏。
(3)安装柱时,请注意流向,接口处不要留有空隙。
(4)样品液请注意滤过(注射液可不需滤过)后进样,注意样品溶剂的挥发性。
(5)测定完毕请用水冲柱1小时,甲醇30分钟。如果第二天仍使用,可用水以低流速(0.1~0.3ml/min)冲洗过夜(注意水要够量),不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是:对于含碳量高、封尾充分的柱,应先用含5~10%甲醇的水冲洗,再用甲醇冲洗。
(6)冲水的同时请用水充分冲洗柱头(如有自动清洗装置系统,则应更换水)
(7)做样或冲洗柱子时,特别要防止流动相的量要足够,以防被抽干,而泵空转.
7、样品测定
1.流动相比例调整:由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度,因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相(按经验,主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜)。所以建议第一次检验时请少配流动相,以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到,请注意充分平衡柱。
2.样品配制:①溶剂;②容器:塑料容器常含有高沸点的增塑剂,可能释放到样品液中造成污染,而且还会吸留某些药物,引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附,影响样品中药物的定量回收,因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3.记录时间:第一次测定时,应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针,并尽量收集较长时间的图谱(如30分钟以上),以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来,确定是否会影响主峰的测定。
4.进样量:药品标准中常标明注入10ml,而目前多数HPLC系统采用定量环(10ml、20ml和50ml),因此应注意进样量是否一致。(可改变样液浓度)
5.计算:由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同,有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示,检验时请注意。
8, 使用记录及维护记录
每天必须作号仪器使用及维护记录,使用记录包括仪器名称,编号,柱子型号,编号,检测器波长,流速,能量,流动相组成,配制日期,,所用到 溶剂批号及厂家,,蒸馏水烧制日期,,以便判断各个溶剂厂家提供试剂质量及查找故障原因. 维护记录要及时作好,包括清洗溶剂瓶,过滤头,过滤器等,更换柱子及其他零部件,写清除零件的数目,部件号等.