主题：[分享]色谱方法验证审评指南 （转贴）

. 药物和药物制剂HPLC验证的参数
虽然许多种HPLC都可采用，但最普遍上报的方法都是用紫外检测器的反相HPLC法，以此作为验证参数的例子。这一方法验证的规定可以扩展到其它检测器和其它色谱。对于验收、出厂或稳定性试验，准确性应最佳化，因为要表明实测值和真值的差异是最为关注的。
A. 准确性
准确性是衡量测量实验值和真值的接近程度。推荐药物和药物制剂的准确性研究在标示量的80%、100%和120%的水平上来进行的，这与“The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation”的规定是一致的。
对于药物制剂，准确性试验通常是将已知量的药物 [按重量或体积（溶于稀释剂）] 以分析对象检测浓度的线性范围量加到空白处方内来完成的。对于液体制剂，这是真实的回收率；而对于诸如片剂、栓剂、透皮吸收制剂等，这不能检测稀释剂中的赋形剂与活性成分间可能产生的作用。实际上要做一个已知活性药物量的单个剂量单位（single unit）来进行回收试验是困难的。准确性试验评价在赋形剂存在时，在分析药物制剂的色谱条件下，试验方法的专属性。但这只是样品制备过程和色谱过程中的回收率，而不是制造过程的影响。
在每个推荐检测浓度重复进样，其重复进样的RSD提供了分析方法的变动性，或是试验方法的精密程度。重复性的均值以标示量的%来表示，这表明试验方法的准确程度。
建议
回收试验在每个水平上（标示量的80%、100%和120%）至少做3份，均数用来估计准确性的，RSD是估计样品分析精密度的。
B. 检出限和定量限
这些限度通常用于药物和药物制剂中有关物质的测定。限度的规定连同药物和药物制剂出厂和稳定性有关的调整杂质量的方法一起要上报。
检出限度是样品中分析对象在实验条件下可被检出的最低限度，但不要求定量。定量限度是样品中分析对象在实验条件下，以可接受的精密度和准确性定量测定的最低浓度。
使用UV检测器时，保证低浓度化合物的检测精密度是困难的，这是由于检测器的灯随着寿命的延长可能逐渐减小其灵敏度，不同检测器制造厂家的躁声水平也不同。在低浓度时，保证每次试验方法能达到检出限度和定量限度是必要的。指定的杂质无对照品，但是又要保证检出限，额外峰可能不出现或出现。对评价额外峰检出的可行的粗糙方法是用以分析对象峰面积的百分比的要求作为检出限。例如检出限要求分析对象峰面积50000的0.01% ，那么给出面积计数为5，则不能检出。
虽然USP表示检出限和定量限分别用躁声水平的2或3和10 倍表示，但这一概念不是很实际的。在方法研究阶段，用不同的检测器分析样品时，检测器的躁声水平是不同的。在定量限水平的试验方法中使用对照品（由申报者提供）能保证杂质可被检出和被定量。
检测器灵敏度因型号和制造厂家的不同而异，见表1。用二种商用检测器分析一种化合物，这些数据不应作为二种检测器灵敏度预期的比例。在设定这些限度时，因为还有起部分作用的其它参数，如灯和柱的寿命，但它们是不知道的。
表1 二种商用检测器的检出灵敏度限度比较
　 检测器1 检测器2
定量限度 0.21% 0.07%
检出限度 0.16% 0.05%
人们应该注意，基线躁声不应解释为额外峰。如果样品的稀释剂与流动相所用的溶剂不同（比例或类型），亦可能在死体积处见到波动。
如果有目标化合物的参考标准品，那么要使用接近定量限的或按规定配制的标准溶液。记录没有参考标准品的杂质峰时，推荐使用药物的稀释液作为参考标准溶液。然后对方法要进行校正，测定的高低浓度都要在药物检出线性范围内 ，否则用相同色谱图下面积或峰高的%表示是有偏差的。应该注意得到的用面积计数的额外峰不能被认为是取决于该化合物UV吸收系数或吸收度的检出响应。
建议
1. 分析重现性和进样重现性数据应在定量限度范围内。
2. 在试验方法的定量限的浓度处，用一外加的参考标准溶液。
C.线性
符合比耳定律的可检出的线性范围取决于被分析化合物和所用的检测器。工作样品的浓度和准确性试验样品的浓度应在线性范围内。
图1和2表明UV响应和浓度的（a）线性和非线性关系。有一点应该注意，当记录杂质峰时（用母体药物的%面积表示），如果使用非线性的浓度曲线部分，观察到的杂质可能不是理论计数的真实反映。另外，仅当杂质和母体化合物的吸收系数或吸收度值相同时才能得到真实的量。杂质参考标准品通常是必需的。

建议
检测的线性范围取决于试验方法的目的，用于含量测定方法的推荐范围为不得过±20%，以峰面积%计的测定杂质的范围是目标浓度的+20%，低至药物或杂质的定量限。在大多数情况下，回归系数要 >0.999，截距和斜率应标明。
D. 精密度
精密度为在相同分析条件下的一组测量值相互接近的程度。ICH定义精密度含有3个部分，即重复性（repeatability）组间精密度（intermediate precision）和重现性（reproducibility）。在USP 1990 ，1225页中的耐用度（ruggedness）具体体现在这一指南的组间精密度，重现性和耐久性（robustness）概念中。
1. 重复性
a. 进样重复性
灵敏度是检出样品中分析对象浓度小量的变化的能力。灵敏度可以通过系统适用性试验中的进样重现性的规定来部分的控制。
多次注射均一样品（制备的溶液）测量的灵敏度和精密度，表明在色谱条件下测定当天HPLC仪器的性能。这一信息作为验证数据和系统适用性试验的一部分。以百分变异系数（CV%）或相对标准偏差（RSD）的规定来测定其分析的变异限度。值越接近人们可以期待结果更精密或对结果的变化更灵敏。这是假设在系统适用性试验后色谱仪功能未失常的情况下的。然而要注意这不是考虑由药品制造和实验室样品制备引起的变异。作为进样和R t的变异的例子，表2提供了在进样过程中色谱系统漏液时收集的数据。四个重复的样品分别进样，注意其峰面积的变异和保留时间的漂移。从性能良好的系统得到的一组典型数据见表3。
表2 进样中色谱系统系统漏液时的重复性数据
样品 R t 峰面积 ΔR t Δ峰面积
A1A2 5.625.66 21556992120466 0.04 35233
B1B2 5.876.13 22056592288355 0.26 82696
C1 C2 6.216.48 22270662265279 0.27 38213
D1 D2 6.736.99 25818882602016 0.26 20128
　表3 色谱系统功能正常时的进样重复性数据
剂型 N 均数±SD RSD
吸入溶液 10 1993162±5029 0.25%
吸入用溶液 10 1722253±6288 0.37%
胶囊 10 1744320±3133 0.18%
建议
作为方法验证的一部分，建议最少10次进样，RSD≤1%。对于药物或药物制剂中的活性成分出厂和稳定性研究，其RSD≤1%。系统适用性试验的精密度RSD至少5次进样。对低浓度杂质，较高的变异系数可以接受。
b. 分析重复性
分析重复性由同一分析者在相同的实验条件下进行的多次测量，用RSD表示。实际上，它常常与准确性一起进行研究，见 . A部分准确性项下。
2. 组间精密度
组间精密度以前作为持久稳定性的一部分。该数据用来评价在与方法研究过程不同的条件下的方法可靠性。目的是保证同样的样品在方法研究期后进行分析能得到相同的结果。
取根据时间和条件，方法可以在多天、多个分析工作者和多台仪器上试验。
良好的系统适用性试验规定可以部分地保证试验方法的组间精密度。因此设定严格的但实际的系统适用性试验的规定是重要的。
建议
作为最低要求，在 .A部分准确性项下得到的数据可分为二种不同的情况，来表明试验方法的组间精密度。
3. 重现性
按ICH定义，重现性表示协作研究的实验室间的精密度。要求有多个实验室，但由于企业的规模的原因，不总是能实现的。
建议
如果组间精密度完成了，重现性一般不要求。
E. 范围
范围是指被研究的分析对象的高低浓度间的距离。也可见 .A部分的A和C的准确度和线性项下。
.A部分的A和C的准确度和线性项下推荐的范围能用于其它分析对象，如防腐剂。
F. 回收率
回收率是用目标化合物的量或重量在介质中的理论量的百分数来表示的。
目标化合物应该得到全部回收。在样品制备过程中，目标化合物从处方的赋形剂中回收；处方的模型范围包括简单的水溶液至复杂的乳剂 ，同时从对容器或密闭包装如玻璃瓶和定量阀的可能的吸附中回收。通常样品制备过程简单，回收变异小，回收率数据的收集在 A部分准确度项下讨论。
G. 耐久性（Robustness ）
ICH定义耐久性是测量方法不受小的但客观存在的参数变异的影响的能力。耐久性能被良好的系统适用性规定部分的保证。因此设置严格的但可行的系统适用性试验是重要的。
部分或全部改变试验条件，如柱的寿命、柱型号、柱温、流动相中缓冲液的pH、试剂等通常是可以的。
建议
耐久性研究得到的数据一般不上报，但建议作为方法验证的一部分。
H. 样品溶液的稳定性
药物或药物制剂依法制备的溶液的稳定性要按试验方法进行评价，大多数实验室供试品在试验条件下，用自动进样器过夜运行来完成。在试验操作完成前，在实验室环境下，样品在溶液中放数小时。特别要注意能通过水解、光分解或玻璃器皿的吸附而降解的药品。
建议

怎么没有人来支持一下啊！！！！！！！！！！！！！！

帮你顶！！！

好帖子我顶！！！！

狠有用，谢谢

好东西啊
多谢指教了

多谢

建议看一下USP27版和ICH 关于分析方法验证的规定吧,有些东东该改一下思路,那里有一些建议和推荐的方法,USP1990的东西有点老了.

好帖子我顶！！！！