主题：【资料】-农药残留检测生物传感器酶固定技术研究进展

1.1 吸附法
吸附法指的是活性酶在电极表面上的吸附，包括物理吸附和离子吸附，是一种最简单的酶固定化技术。这类农药残留检测生物传感器的酶固定主要利用载体材料表面积大或特性吸附实现对酶的固定，无需化学试剂，对酶的活性影响小，具有操作简单、步骤少、同其它化学方法相比，物理吸附具有很少发生酶降解等优点。但固定后的酶易从基体上脱落，存在稳定性和重现性差，且生物酶存活时间短等问题，而不被广泛应用。崔卉等以醋酸纤维膜片为载体，先进行活化处理，再浸入含乙酰胆碱酯酶为5mg/mL溶液中进行吸附80min.即可实现对酶的固定。Satish Kumaran等通过物理的吸附方法将丁酰胆碱脂酶(BuChE)吸附在预先活化的尼龙! 聚酰胺膜上，并用尼龙网将载有酶的膜片固定在玻璃pH 电极上制备成电位型生物传感器， 并对土壤中提取的机磷杀虫剂二嗪农和杀螟硫磷的残留进行检测，检测限分别为35ng/g和21ug/g。通过这种方法得到的酶电极虽制作简单， 但酶电极在缓冲溶液放置3-7天后， 由于酶的固定不稳定， 使得酶活性损失高达65-6%。NiKos A.chaniotakis 等采用纳米孔径活性碳、二氧化硅材料将酶吸附固定在孔内， 由于纳米孔表面张力作用使得酶固定后稳定性高， 且孔径与酶直径相符， 酶呈非折叠立体状固定， 使得固定在纳米孔径碳、二氧化硅的酶的活性分别高达115%和103%， 这为简单固定酶的同时保持酶的高活性提供了新的方法。

1.2 共价键合法
共价键合法是指酶分子通过共价键与电极表面结合而固定的方法。在酶生物传感器研究中研究者为了克服酶的稳定固定和实验重现性的问题，往往采用在基体上修饰上活性基团，或直接采用带活性基团的载体：如硅烷基化或将电极表面氧化成活性基团后，与酶的侧链基团结合形成稳定的化学共价键而达到固定的目的。这种固定方法在农药生物传感器研究上得到广泛应用。E.Wikins等在有机溶剂中定量检测有机磷农药的研究中，采用的是乙酰胆碱酯酶安培型生物传感器。他们在石墨电极的裸露面上电沉积聚乙烯胺- 普鲁士兰（电子媒介物）的薄膜，再通过聚乙烯胺-普鲁士兰的薄膜的活性基团-氨基与酶的侧链基团进行共价键结合而实现对乙酰胆碱酯酶的固定。在对有机磷农药检测中，响应时间仅为10min，固定在生物传感器的酶在干燥环境中能存活2个月以上，检测限达10^-8mol/L。F.N.Kok和V.Hasirci等以聚甲基丙烯酸-2- 羟基乙酯（pHEMA）高分子膜为载体，分别通过辛巴蓝F3G-A（CBF3G-A）和环氧氯丙烷活化，使pHEMA 高分子膜表面产生活性基团，再分别与乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶氧化酶（ChO）进行双酶固定10h和4h后形成稳定的共价键。并分别对单种有机磷农药和双组分有机磷农药进行了检测，发现有机磷农药对酶的抑制作用的选择性不强，但是酶的结合力明显增强了。共价键合固定酶的方法使酶的结合力增强了，但是存在酶的活性基团也参与反应从而导致酶活性降低的问题。

1.3 凝胶/溶胶法
凝胶/溶胶因具有介/纳米孔径，有大的比表面积，对酶产生强大吸附能力，对酶活性无损伤，这种固定酶方法倍受研究者关注。魏祥福等以海藻酸钠形成凝胶，以戊二醛为交联剂，牛血清白蛋白（BAs）为保护剂，高岭土为支撑物包埋乙酰胆碱酯酶，组装成生物传感器，该法固定酶具有重现性好，比单纯用交联法固定存活时间长，在3℃能保存40天。康天放等先以正硅酸异酯（TEOS）为原料水解制备出二氧化硅溶胶，再和一定比例的乙酰胆碱酯酶混合，最后涂于醋酸纤维膜表面制备成敏感酶膜，再将酶膜固定在聚四氨基钴酞箐(P-CoTAPc)修饰的玻碳电极(GCE)上制备的传感器分别对有机磷农药对硫磷和辛硫磷进行检测，并对二氧化硅溶胶与乙酰胆碱酯酶体积比例进行研究，发现最佳比为0.4，检测限可达2.0×10-9mol/L和1.4×10-9mol/L。Panote Thavarungkul小组以活性二氧化硅固定乙酰胆碱酯酶，制备成生物传感器对水中的甲胺磷进行检测，并对二氧化硅固定乙酰胆碱酯酶量进行优化。Doong等用凝胶/溶胶技术将异氰酸荧光素（FITC）固定在敏感酶膜上，与光纤束、紫外灯、聚光镜、光电倍增管和微机组成光纤型生物传感器，在0.5-20mmol/L浓度范围内的底物有很好的线性响应，重现性好。


    

1.4 聚合物包埋修饰法
聚合物包埋法是将酶或细胞包埋在高分子聚合物三维空间网状结构中的固定方法。它有一些优异的特点，使得该技术成为固定酶方面是最普遍使用的固定技术：（1）可采用温和的实验条件；（2）酶易于渗入聚合物薄膜，且不产生化学修饰，对酶的活性影响甚小；（3）薄膜孔径和几何形状易于控制：（4）包埋的酶不易泄露，同时还能用其它辅助固定技术，如共价键合和交联法进一步改进酶包埋的稳定性。然而，这种固定化技术也存在一些局限性，如聚合物形成过程中产生的自由基对酶的活性基团有影响，而使酶的活性降低，聚合物的空间结构使之局限于测定较小尺寸的物质，而且这种传感器难以微型化等缺点。Georg Schwedt等将乙酰胆碱酯酶包埋在丙烯酰胺/甲基丙烯酰胺共聚物的薄膜中，形成敏感酶膜，随后将敏感膜固定在pH 电极表面，构成了电位型生物传感器。实现了对对氧磷和马拉硫磷农药的检测，检出限分别达到1×10^-9mol/L和1×10^-19mol/L，抑制时间仅为8-10min。G.A.Evtuogn等先用0.5%聚苯胺在玻碳电极表面进行修饰，然后用交联试剂戊二醛将乙酰胆碱酯酶与聚合物交联起来，形成无电子媒介物的敏感酶膜。该法固定酶的过程简单，所需试剂少。而检测重复性、下限、灵敏度都有所提高，对蝇毒磷、敌百虫、灭虫威检测下限分别达到：0.002mg/L,0.004mg/L,0.008mg/L, 这为水的污染物的检测，不用浓缩直接进行检测奠定了基础。

1.5 交联法
交联法是指通过双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶、聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定的方法。最常用的交联剂是戊二醛，能在温和条件下与蛋白质的自由氨基反应，如下式所示:

这种方法的缺点是膜的形成条件不易确定，须仔细的控制pH、离子强度、温度及反应时间等。中国军事医学科学院李元光小组用1%牛血清白蛋白（BAS）和0.1U乙酰胆碱酯酶混合液滴在先行处理过的玻碳工作电极表面，干燥后，放于事先准备好含100mL戊二醛的层吸缸熏蒸3min，这种方法制备的传感器能很好的实现对对硫磷除草剂的检测，浓度范围在1.8×10-7mol/L-5.4×10-5mol/L. 有很好的线性关系，相应的对乙酰胆碱酯酶活性抑制率为10.3%-88.8%。A.N.Lvanov等将乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白（BAS）混合液直接涂在抛光的Sb作电极表面，然后用戊二醛蒸气熏蒸来固定酶，用这种方法制成的传感器对敌百虫进行检测时，其检测下限达0.01mg/L. 在0.01mg/L-1.1mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，明显高于酶固定在尼龙上的酶电极。Holger Schulze等用戊二醛为交联剂，牛血清白蛋白（BAS）为保护剂，通过戊二醛交联作用将人乙酰胆碱酯酶（huAchE）固定在丝网印刷电极上，这样制备得到的生物传感器，不需对婴儿食品进行处理，能直接进行农药残留检测，检测限高达5μg/Kg，远高于欧盟105μg/Kg标准残留要求。康天放等用交联法将乙酰胆碱酯酶固定在醋酸纤维膜上，再将醋酸纤维膜固定在已修饰四氨基钴酞菁电子媒介的玻碳电极表面上。对对硫磷和乐果的检测下限达7.0×10-10mol/L和2.6×10-10mol/L该敏感酶膜经活化后可重复使用10-12次之多，为农药残留检测生物传感器的实际应用展示了良好的前景。

1.6 其它方法
Bogdan Bucur等 以在丝网印刷石墨电极上修饰一层7,7,8,8,tetracyanoquinodimethethane(TCNQ)作为电子媒介物后，再修饰上带二价镍离子金属螯合物，而乙酰胆碱酯酶修饰上带胺基基团（His）形成AchE-His后。再通过二价镍离子与胺基上的氮原子配位将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面。该法需要酶量极少仅为0.8mIU，响应时间仅为1-2min，在底物在10-300×10-6mol/L. 浓度范围内有很好的线性关系。这为节约酶的使用量，提高响应时间方面具有很好的探索意义。

2 固定化载体
酶对固定载体材料有很高要求，如要有良好的机械强度、价廉、稳定性、和良好的生物相容性等。针对胆碱酯酶的固定化载体，酶专家和分析化学工作者作了大量的研究，并开发了许多载体材料：如高分子材料、油墨粉、介孔材料、玻碳电极、碳纤维等。

2.1 高分子材料
高分子材料由于易合成，能按预先设计路线来合成和操作性强等优点在农药残留检测生物传感器方面作为载体材料而被广泛应用：如尼龙网机械性好、稳定性高、价廉、带有活性基团氨基和羰基、并且容易用化学方法固定酶等优点，常用作固定化酶载体使用。高分子材料纤维素通过改性后得到多种特性的改性纤维素：如硝酸纤维素膜对生物分子有较强的吸附作用，醋酸纤维素膜不易燃烧、性质稳定，易于常温保存等。

2.2 介孔材料
人们在研究蛋白质固定时，发现载体材料的孔径为蛋白质直径的2-6倍时，蛋白质能以非折叠形式被固定，蛋白质活性得到了极好的保护。活性介孔碳、二氧化硅、三氧化铝材料因其孔径可控，并且具有介- 纳米孔径，有大的比表面积，对酶产生强大吸附能力，具有很好的生物相容性，对酶活性无损伤，被研究用于各种酶的固定载体材料。人们已成功将活性介孔碳材料用于葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶和丙酮酸氧化酶的固定。介孔二氧化硅在固定酶时，发现其表面特征和孔径是固定酶的关键因素。Nikos A. chaniotakis等分别采用纳米介孔碳、二氧化硅作为载体材料，将酶呈非折叠立体状被吸附在孔内固定，并得到了高活性的酶。

2.3  碳材料
碳材料因具有很好的生物相容性、强的机械性能、优异的导电性、价廉作为生物传感器的载体材料研究备受关注。油墨粉因导电性好、易印刷是丝网印刷术的常采用的电极材料，常用来做胆碱酯酶固定的载体。玻碳电极、碳纤维有很好的强度、导电性，也被用作固定胆碱酯酶的载体。自从纳米碳管被发现以来，由于碳纳米管修饰电极具有很好的电化学和化学稳定性、良好的导电性、大的比表面积和优良的电催化性能，能促进电活性物质的电子传递等优点。使人们对碳纳米管在电化学中的应用产生了极大的兴趣。目前，碳纳米管被用来作为电活性材料和电活性材料的载体已广泛应用于电化学和生物传感器研究。随着碳纳米管制备技术进一步发展，生产成本的逐渐下降，有望在一次性农药残留检测生物传感器中作为酶的载体应用。

3 存在问题与发展方向
生物传感器的固定技术获得空前发展，为农药残留量大规模、快速、实时在线、价廉的检测方法提供了可能。但生物传感器在农药残留检测方面还存在稳定性、重复性、不能多组分检测，以及在酶固定后酶的活性损失和存活时间短等问题。如何采用新的固定技术，使酶的固定过程简单，保护酶的活性、提高存活时间，提高检测的稳定性、重复性和多酶共同固定是目前面临的主要问题。采用新的载体材料结合微电子集成和信息技术，制备新型微型农药残留检测生物传感器为实现实时、在线原位检测、提高灵敏度等，是农药残留检测生物传感器发展的方向。

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酶的固定化还有很多种吧，纳米级酶固定化也算其中一种吧？