主题：【转帖】HPLC法在药物对映体的分离和测定中的应用

2　直接方法

　　直接方法是在分子间引入手性环境，即采用手性流动相或手性固定相不经柱前衍生化直接分离药物对映体的方法，该法近年发展迅速。
2.1　手性流动相拆分法　向流动相中加入一手性试剂，它与溶质常以氢键、离子键或金属离子的配位健生成非对映体缔合物，从而以常规HPLC固定相分离。分离机理为：(1)在流动相中形成立体选择性复合物；(2)手性流动相添加剂（CMPA）与固定相之间发生作用，形成动态的CSP，该法可通过改变CMPA的种类、浓度及流动相的组成而优化分离条件。
常用的CMPA主要有：(1)环糊精类［8］　主要是α-、β-和γ-环糊精及其衍生物。Eto等［9］用β-环糊精测定了数种巴比妥类和乙内酰脲类药物在生物体液中的对映体浓度。谢剑炜等［10］用β-环糊精手性流动相添加剂，用反相HPLC法首次抗胆碱能药物盐酸戊乙奎醚、盐酸苯环壬酯和盐酸卡马特灵，3个手性药物4对对映体完全达到基线分离。(2)手性离子对试剂，karlsso［11］等以N-苯甲酰甘氨酰脯氨酸作为CMPA，分离测定了血浆中（R）-和（S）-普萘洛尔。与HPLC中的离子对法的差别主要在于前者是手性离子对试剂，由于CMPA价格昂贵，其体系稳定性差等原因，应用受到一定的限制。范柏［12］等用L-苯丙氨酸为配合剂，Cu2+为配合离子，用简便的手性配合交换反相HPLC法成功拆分了氧氟沙星对映体，手性流动相为6mmol.L-1 L(D)-苯丙氨酸，3mmol.L-1硫酸铜-甲醇（83∶17）。
2.2　手性固定相拆分法　由于CSP技术的飞速发展，采用CSP分离对映体化合物的方法应用越来越广泛。目前，商品化的手性柱已有数十种，却无一具有类似ODS柱那样普遍的适应性，且价格昂贵。随着手性识别机理的深入研究，新方法、新理论不断提出，预计将会有价廉、适应性广的CSP面世。(1)环糊精键合相α- 、β-和γ-环糊精（CD）是分别由6～8个葡萄糖单位通过α-(1、4)连接构成的环状低聚糖，CD-CSP通过共价键将CD分子键合到硅胶上，形成对水稳定的键合相。β-CD键合相的立体选择性较好，应用最多。β-CD柱上分离较好的化合物通常其手性中心为分子中环状结构的一部分，或至少与两个SP2杂化碳原子相连［13］。Berthod等［13］采用商品的β-CD柱（Cydobond Ⅰ)和γ-CD柱（Cydobond Ⅱ)拆分了25种不同类型的手性药物，其中对映体之间达基线分离的有11种。(2)吸附络合物形成相　要想实现手性识别,手性化合物与CSP之间至少应存在三种相互作用,称为三点识别模式［14］。这些作用可以是氢键、静电作用、疏水作用、π-π作用、偶极-偶极作用或空间作用，一般通过将某些氨基酸，如（R）-或（S）-苯基甘氨酸等分子中的α-氨基与3，5-二硝基苯甲酰氯反应后，离子或共价键合到氨丙基硅胶上而制得。该类固定相通常按正相方式操作，其在药物分析中应用较少，后来，RUSTUM等发现也可使用反相分离系统，从而扩展了其应用范围。(3)手性聚合物相　用不同方法将纤维素衍生物涂复于大孔硅胶上而制得，在此类固定相上得到成功分离的化合物大都含有苯基、羰基、腈基、磺酰基或羟基等。目前，纤维素—三（3.5一二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固定相应用较多。例如，用三（3，5-二甲苯基氨基甲酸酯）纤维素衍生物为CSP对血浆中普萘洛尔对映体的测定［15］。Shibukawa等人［16］采用3，5-二甲苯基氨基甲酸酯衍生化的直链淀粉手性固定相（AD-CSP）分离了维拉帕米及其代谢产物去甲维拉帕米的对映体，方法的线性范围为2.5～100μg.L-1。(4)蛋白质键合相　以离子键(或共价键)和蛋白交联作用将蛋白质固定于硅胶上，利用蛋白质分子与手性化合物分子间的立体选择性作用，进行药物对映体分离,其机理一般有氢键、静电作用、疏水作用、离子对和离子交换作用。将α1-酸性糖蛋白（α1-AGP）固定到硅胶上而制得AGP柱可直接分离许多碱性、酸性及中性药物对映体。钟大放等［17］用CHIRAL-AGP柱，选择不同流动相分别拆分了SFZ-47、KMBZ-009和地丙苯酮3种药物的4对对映体，并研究了SFZ-47在家犬体内的药代动力学。Schmidt［18］等人以α1-酸性糖蛋白为CSP测定人体血浆中美沙酮对映体的含量。Orn等［19］以α1-酸性糖蛋白为CSP可使α2-拮抗剂medetomidine-HCl对映体在8min内实现基线分离。
由于光学异构体往往存在生物活性的巨大差异，因此，对映体拆分研究的最大受益者可以说首选药学，在研制含手性中心的新药过程中，也应分别评价单个对映体的效能、毒性及药动学性质。随着高效，简便快速，易于自动化的手性药物分析技术的发展，必将把手性药物的鉴定、研究及其质量控制和生产推进至一个崭新的发展时期。