主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之五）

7. 仪器
7.1 托盘天平
7.2 分析天平
7.3 磁力搅拌器
7.4 旋涡混合器
7.5 冰箱，+4℃
7.6 通风橱
7.7 多样品试管浓缩器
7.8 半自动吸管，具有一次性尖嘴5-40μL，40-200μL，200-1000μL，1-5mL。
7.9 Millipore RO60 反渗透和MilliQ去离子水系统。
7.10 翻转混合器
7.11 固相萃取系统
7.12 在15℃充满200bar压力的氦气钢瓶。
7.13 HPLC控制器
7.14 HPLC泵 2150X2（LKB）
7.15 可变波长检测器，2151 设置波长为450nm（LKB）
7.16 积分仪
7.17 柱温箱
7.18 Microsorb C-18(Octadecy lsiland)80-215-C5柱: 15 cm×4.6 mm ID
7.19 Toflon, 10英尺长反应管(0.023in ID)
7.20 低死体积混合器（LKB）
7.21 Rheodyne 进样器（Model 7125）
7.22 玻璃管 75×10 mm
7.23 玻璃管125×16 mm
7.24 玻璃瓶和盖子29.5mL(Fsa Lab Supplies, Cat No BM14)
7.25 刻度玻璃吸管10mL和25mL
7.26 量筒：100mL和500mL
7.27 100mL容量瓶
7.28 氮气输送及导管

8. 样品和取样程序
注：注意事项见ISO文件78/2-1982 6.3.1节,以下注解选自2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品性质 ：样品应符合64/433/EEC指令中规定的测定肉中药物残留的要求。如果没有此类样品，生物体液或粪便可组成测定残留的样品。
8.2 抽样量：抽样量必须满足检测和复验对样品量的要求。
8.3 样品的保存和包装应符合在实验室中能正确识别的要求。
8.4 包装、贮存、运输时必须保持试样的完整性，不能影响检测结果，用于分析磺胺二甲嘧啶的试样必须在-18℃以下贮存和运输。

9. 测定步骤
9.1 所有样品均应单独制样。
9.2 称取约相当于2.5g±0.01的鱼组织的样品(大约0.60g)于玻璃瓶(7.24)中。
9.3 用结果阴性的组织中加入50μL控制溶液（6.3.3）制备控制样品。
9.4 于所有玻璃瓶(7.24)中加入2mL碳酸盐/碳酸氨盐缓冲液（6.2.1）
9.5 盖上盖，然后旋涡振荡约1分钟。（7.4）
9.6 加入15mL二氯甲烷（6.1.1）
9.7 在翻转混合器上[约60rpm(7.10)]翻转混合所有的玻璃瓶20分钟。
9.8 从玻璃瓶中倒出二氯甲烷于另一个干净的玻璃瓶中，并盖上盖。
9.9 从玻璃瓶中移出12mL并转移到试管(7.23)中，如果不能足够的移出12mL,则尽可能转移，最终的计算必须作相应的修改。
9.10 使用Baker 固相萃取系统（7.11）和硅胶柱(6.1.14)，用6mL 二氯甲烷调节活化柱子，在样品加入前不能让柱子流干。
9.11 在每一个柱子中加12mL各个样品（9.9）提取的二氯甲烷,以5mL/min的速度使其通过柱子。
9.12 再用6mL 二氯甲烷（6.11）冲洗柱子,然后在10psi的压力下,用空气干燥该柱10min。
9.13 用3mL 甲醇（6.1.2）从每一柱子中洗脱样品，缓慢通过柱子,洗脱时间多于20分钟。用试管收集洗脱液。
9.14 用多样品试管浓缩器挥发洗脱液。
9.15 用1m L 50：50（V：V）甲醇/去离子水（6.2.2）溶解残渣,供HPLC分析之用。
9.16 HPLC
9.16.1 测定波长设在450nm（7.15）。
9.16.2 启动柱温箱到40℃，并让其加热30分钟（7.17）。
9.16.3 起动一个泵（PumpA）流速成为：1mL/min,另一个泵（PumpB）流速为0.5mL/min.
9.16.4 以甲醇(氦气脱气2min）通过两泵5min。
9.16.5 由泵A泵入两流动相（6.2.5） 平衡系统，由泵B泵入N，N—二甲基—氨基苯甲醛（6.2.3），通过 分析柱（7.18）,混合池（7.20）,反应圈以及检测器（7.15）持续30min。
9.16.6 取50 μL标准工作液（6.3.2）进样,校准该系统。
9.16.7 取5 μL提取物（9.15）进样，每次分析约需10min,磺胺二甲基嘧啶的保留时间约为4min。
9.16.8 分析完毕,进最后一个样品后，以甲醇冲洗系统，过夜。

10. 结果计算
10.1由标准溶液的峰高得出相当于1ng/50μL的标准品峰高，即由总的峰高除以标准物质的含量值得出。
如对于40ng/5μL标准溶液；

40ng/5μL标准溶液峰高
（1ng/50μL）峰高 = ---------------------------------
40

磺胺二甲嘧啶在样品中的（9.15）的含量，可以通过用它们的峰高除以1 ng/50 μlL准溶液的峰高得出，结果的单位为ng/50μL，该单位根据需要可转换为 ng/mL或ng/g。
10.2 数据确证
10.2.1 肝
从未经药物处理过的冷冻干燥的肝样品（相当于2.5g肝）添加0.625μg磺胺二甲嘧啶 ，其回收率是91.3±7.5%,CV=8.2%(N=6)。
6个经随机选择的来自一批经过冷冻干燥处理的的标准物质,肝样品，在不同的三天内进行分析，根据假设的因子（小于4），结果是多样性的，以避免在将来MAT组织的协同研究中产生不适当的影响。
μg/kg CV%
第一天 2018±124 6.1
第二天 2040±138 6.8
第三天 1868±50 2.7
平均日测定值（内部分析）为：1976±96 μg/kg;CV=4.7%
10.2.2 肾
取未经药物处理的冷冻干燥的肾样品，（相当于2.5g肾）添加0.625 μg 磺 胺二甲嘧啶 ，回收率为83.1±3.6%，CV=4.3%（N=6）。
6个随机选择的同一批的冷冻干燥的肾样品标准物质， 在不同的三天进行分析，以避免在将来由MAT举办的协同研究中产生不适当的影响，根据假设的因子(小于4),结果是多样地。
μg/kg CV%
第一天 1266±45 3.6
第二天 1320±24 1.8
第三天 1257±54 9.3
平均日检测值（内部分析）：1281±35ug/kg CV=2.7%
10.2.3 肌肉
来自未经药物处理的动物的冷冻干燥的肌肉样品（相当于2.5g 肌肉），被添加了0.625μg磺 胺二甲嘧啶。其回收率是80.7±13.3%，CV=16.4%（N=6）。
来自于同一批经参考物质处理的动物的6个随机选择的冷冻干燥的肌肉样品，在不同的三天内进行分析，为了避免在将来由MAT举办的协同研究中产生不适当的影响，根据假设的因子（小于4）该结果是多样地。
μg/kg CV%
第一天 1400±43 3.0
第二天 1414±48 3.4
第三天 1193±36 3.0
平均日测检测值（内部分析）为：1336±124ug/kg CV=9.3%

11. 特殊情况

12. 有关操作步骤的注意事项
磺胺二甲嘧啶在新鲜或冷冻的组织中是不稳定的，事后检验的代谢产物的比率在低温储存过程中可被降低。然而，其反应是多变的且是不可预知的。在标准物质中，由加入达到最终浓度为0.013%的水杨乙汞，并使其稳定，并且通过二次冷冻干燥可去除可用的水。在此浓度下，水杨乙汞在HPLC分析步骤中无影响，然而它可干扰免疫和微生物分析步骤，在实施提取以前，冷冻干燥导致的细粉未必须被重新水化。为此，碳酸氢盐缓冲液是更好的选择，并可提高提取效率。有关重新加工的组织粉末或提取物的稳定性尚未进行研究。

13. 质量控制
猪肌肉、肝和肾的磺胺二甲嘧啶的标准物质已经制备，现正在进行内部比较和确证研究（见第8节）。

14. 检测报告

15. 缩略语

16. 检验流程图
均质 洗脱
组织冷冻干燥物 溶剂提取 SPE HPLC 结果计算
分散

不错的资料，要是作为附件放在一个贴子里供下载就更好了．多谢分享