7. 设备
7.1 气密和水密性反应管,10mL和20mL
7.2 匀浆机(Ultra-Turrax型号)
7.3 磨口抽提管,50mL
7.4 +4℃冰箱
7.5 -20℃低温冰箱
7.6 离心机
7.7 TLC辅助设备,如溶剂罐
7.8 紫外灯(UV),366nm,带参比滤光片或保护性的色谱镜
7.9 玻璃柱,长约300mm,内径4mm,外径6mm
7.10 200mL的玻璃烧瓶(带B14玻璃接头)
7.11 平口针尖的微量注射器(1μL,10μL,100μL)
7.12 汞化树脂的制备
20mL Dowex1χ2(50-100目,分析级)连续用10倍于填充物体积的蒸馏水、0.5M NaOH、蒸馏水、0.5M乙酸、蒸馏水冲洗。将湿树脂(20mL)与200mL2,7-二溴-4-羟基汞基荧光素水溶液(500mg溶于200mL水中)混合震荡24小时。汞化的树脂再用水洗至洗脱液无色。再用100mL 0.1M HCL、0.5M NaCL处理、500mL蒸馏水水洗、100mL 0.1M NaOH处理、500mL蒸馏水水洗,树脂保存于暗处。
7.13 净化过程所用层析小柱的制备
见图 (1)玻璃柱,内径4mm,外径6mm
(2)玻棒,内径3mm
(3)与硅胶管连接
(4)硅胶管,内径0.3mm,外径0.7mm
(5)硅胶管,内径0.5mm,外径1mm
(6)硅胶管,内径0.5mm,外径4mm
(7)玻璃漏斗
R-----树脂
柱充满水后移去玻棒,约含0.6mL的汞化树脂水悬浮液通过漏斗加入至树脂沉淀高为5cm,移去多余的树脂并加玻棒于树脂之上。柱备用。
7.14 HPTLC
7.14.1 薄层板:涂有硅胶60的铝板,无荧光显示剂(如Merck No. 5613或5547)。薄层板使用前110℃活化并放置过夜。
7.14.2 溶剂: 可选用系统A或系统B。
系统A:
7.14.2.1A 第一次展开剂:三氯甲烷:乙醇 95:5(V/V)
7.14.2.2A 第二次展开剂:三氯甲烷:丙酸 95:5(V/V)
系统B:
7.14.2.1B 第一次展开剂:二氯甲烷:甲醇 98:2(V/V)
7.14.2.2A 第二次展开剂:二氯甲烷:丙酸 98:2(V/V)
7.14.3 显色剂: 参见6.11
上列试剂生产公司及产品仅供参考,相当试剂同样合适。
8. 样品及取样程序
8.1 样品属性:样品应符合64/433/EEC指令中,关于进行肉样中进行兽药残留检测的要求。如果没有此类肉样,也可用动物的体液或排泄物作为样品来进行残留检测。
8.2 样品量:其数量必须满足本实验要求,必要时须满足复验所需的量。
8.3 样品的传递与包装须满足实验室的能正确识别的要求。
8.4 包装、保存、运输的方法必须保持样品的完整性并不致产生检验结果的偏差。分析甲状腺抑制物的样品的保存与运输须在-18℃以下。
9. 测定步骤
9.1 取动物组织2g,2mL尿,血浆或脱脂奶,加入10mL甲醇后用一Ultra-Turrax匀浆机(7.2)匀质。
9.2 加入含0.2μg内标DMTU的溶液100μL(6.12.2),匀浆液用10,000rpm(12,000g)离心10分钟。
9.3 倾出上清液,过汞化柱(7.13)。小心上下移动玻棒赶去气泡。
9.4 10mL水洗柱后,甲状腺抑制物随5mL洗脱液(6.7)洗出。
9.5 100μL 4M NaOH和1mL缓冲液(6.12.4)中和洗脱液,并调PH=8。
9.6 加入0.1mL试剂(6.8),40℃黑暗处反应1小时。最佳反应时间依赖于NBD-Cl的性能,在1-2小时间变化。须预先确定最佳反应时间。
9.7 滴加0.2mL 6M HCl调整反应混和物的pH为3-4。
9.8 先后用3mL、2mL、2mL乙醚抽提NBD衍生物,无水硫酸钠(0.5-1g)干燥抽提混和物。不得有水。
9.9 根据检测的浓度需要,用氮气流吹去乙醚,使混和物体积在0.2-1mL。
9.10 混合0.1mL的标准品储备液于5mL缓冲液(6.12.4)中预备衍生化。依照9.6—9.9的步骤衍生化,蒸发乙醚至体积为2mL。
9.11 用50-100μL提取物(9.9)进行双向HPTLC展开。
9.12 薄层板先在第一展开剂(7.14.2.1A/B)中层析,小心吹干后再在第二展开剂(7.14.2.2A/B)中层析。
9.13 标准品在与样品同时衍生化后,可与样品抽提物平行进行第二次展开,以便准确的判别各个甲状腺抑制药物。
9.14 用半胱胺酸的显色剂对展开后的薄层板进行喷雾显色来判别斑点。在未喷显色影剂前斑点无法看见,显色后样品在兰色背景下呈黄色荧光点。在366nm下以可疑的甲状腺抑制物和内标物的相对荧光强度进行比较来检测。
注:薄层板放置过夜将可减少检测干扰物质。
10. 结果计算
10.1 鉴别
阳性样品斑点呈黄色、荧光状,应与标准品有相同的Rf值。使用7.14.2.1A和7.14.2.2A展开剂,与内标DMTU的相对Rf值应与表1中的数值相当。
表1. HPTLC法甲状腺抑制物与DMTU的RRf
甲状腺抑制物 第一次展开后的RRf 在第二次展开后的RRf
DMTU 1.0 1.0
TU 0.34 0.22
MTU 0.59 0.43
PTU 0.73 0.77
PhTU 0.94 0.89
TAP 1.09 0.53
数据来自EEC工作文件VI/3186/84-EN,文件6.21 II-4
10.1. 回收率
经汞化柱后甲状腺抑制物TU、MTU、PTU、DMTU的回收率>78%,而PhTU为17%,TAP 60%。
添加至肉、血浆、奶中的内标物、DMTU的回收率见表2
表2. 100μg/kg DMTU添加回收率
样品 检测的结果±SD(μg/kg)
PTU MTU TU
肉 106±5.5 102±13.7 97±21.8
血浆 84±6.2 98±5.0 76±5.7
奶 88±6.9 105±3.6 85±8.0
10.2 准确度
10.2.1 重现性:按添加浓度100μg/kg加入至肉样品中,对方法的每一测定步骤进行精密度实验,其重现性测定结果见表3,数据由De Brabander、Verbeke、GhenT提供。
步骤 N 回收率
平均值±SD(μg/kg) 变异系数(%)
柱层析 26 81±3.9 4.8
衍生化 26 76±5.0 6.6
HPTLC 22 88±4.7 5.4
总过程 22 55±6.9 12.6
11-15. 略
见附录I,第12部分。
16. 检验流程图
动物组织 加入甲醇与内标物 匀质 汞化柱渗滤
衍生化 HPTLC 366nm荧光检测
结果计算