主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之二十五）

牛尿中己烯雌酚残留物的测定——放射免疫法（EEC，筛选法）
METHOD FOR THE DETECTION OF RESIDUES OF DIETHYLSTILBOESTROL IN BOVINE URINE USING RADIOIMMUMOASSAY(RIA)(EEC,Sg1.3 Screening Method)
1、引言
欧盟一直禁止在食物性动物中使用1，2-二苯乙烯类药物。
2、主题内容及应用范围
本分析方法描述了牛尿中己烯雌酚(DES)的测定。其检测限为己烯雌酚
0.23μg/L尿，其定义为空白测定标准差的三倍。按20个样品空白检测标准差的六倍计，其检测限为0.38μg/L。
3、参考资料
ISO Standard 78/2-1982 layout for standards-Part 2:Standard for Chemical Analysis

Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action. （OJ. No.L.118, 14.4.93. PP 64-74）

Standard Operating Procedure for the estimation of diethylstilboestrol in urine from the Central Meat Control Laboratory, Dublin, Ireland.

Other references.
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4、定义
己烯雌酚量为:根据所叙述方法测定,不管其化学形态，所测得样品中己烯雌酚的含量，以μg/L表示。
5、方法提要
本法包括5个步骤：
——在缓冲液中稀释尿液
——缓冲液均质液用酶进行共轭水解
——用乙醚萃取己烯雌酚
——最后用放射免疫分析法测定
——通过标准曲线内插法和引入回收率来计算己烯雌酚量
6、 萃取动物组织试剂
注： 已知所引用例证的试剂的来源是满意的，尽管如此,其它来源的试剂同样适合。
6.1 化学试剂
6.1.1 丙酮
6.1.2 干冰
6.1.3 乙醚(无过氧化物且高纯度)
6.1.4 无水磷酸二氢钠
6.1.5 无水磷酸氢二钠
6.1.6 氯化钠
6.1.7 硫柳汞（thiomersal）
6.1.8 明胶
6.1.9 甲醇
6.1.10 净化水一经逆渗透，后经去离子吸收和过滤
6.1.11 氚标记己烯雌酚，-20℃保存（91Ci/mmol, 1mCi/mL）
6.1.12活性炭（）
6.1.13 葡萄糖(Pharmacia T70)
6.1.14 闪烁液（Optiphase Hisafe 11-LKB）
6.1.15 己烯雌酚的抗体，-20℃贮存（Marloie，比利时），交叉反应：与反式己烯雌酚为100%，与反式己烯雌酚 dipropionate为97%，己烷雌酚3.3%，双烯雌酚1%，其它1，2-二苯乙烯类＜0.4%，其它合成性激素类固醇＜0.1%。
6.1.15 氮
6.2 标准品
6.2.1 己烯雌酚（）
6.3 溶液
6.3.1贮备液:( 100ng/mL)溶解100mg己烯雌酚于甲醇中，定容100mL，用甲醇配成浓度为100ng/mL，-20℃保存。
6.3.2 工作液：用甲醇稀释贮备液制成不同浓度己烯雌酚标准工作液。分别为：5，10，20，50，100，200和500 pg/mL，4℃保存。
6.3.3磷酸盐—明胶缓冲液—4.68无水磷酸二氢钠（Analar BDH），8.66g无水磷酸氢二钠（Analar BDH），9.0G NaCl（Analar BDH），0.1g 硫柳汞（ BDH）,1.0g明胶（BDH）用纯净水定容至1L，于4℃保存。
6.3.4 β—葡萄糖醛酸酶（如），用10倍体积的重蒸馏水溶解。
6.3.5 活性炭悬浮液—5g活性炭（6.1.12）0.5g，葡聚糖（6.1.13）用磷酸盐缓冲液（6.3.3）定容至1L。
6.3.6 氚标记己烯雌酚：用10mL甲醇稀释50μL 贮备液（6.1.11)，其放射性浓度约2μCi/mL，-20℃保存。
6.3.7氚标记己烯雌酚分析液：将6.3.6贮备液蒸发，并重新溶解于缓冲液中，制成10,000CPm/0.1mL。当日配制使用。
注：必须测定氚标记己烯雌酚的非特异性结合，且如果它超过总计数的10%，氚标记己烯雌酚应予再提纯或替换。
6.3.8 用缓冲液6.3.3制备抗体溶液。必须按制备抗体的有关说明要求制备抗体，缓冲液中抗体浓度应比最终RIA分析保温混合液所需要的浓度高8倍多。