主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之二十四）

牛尿中残留人工合成激素规检测 ——气相色谱/质谱（EI）法 （该法可扩展为确证法）
A Routine Method for the Detection of Residues of Anabolics in Boving Using GC-MS in the Electron Impact Mode
操作注意事项及急救： 处理酸、碱和有机溶剂应戴手套。在通风橱中处理溶剂。
前 言
EEC一直禁止在动物性食物产品中使人工合成激素，而且不允许输入至共同体或在共同体生产的动物制品中含有这些人工合成激素的残留。在严格控制下，天然类固醇及其酯类的制剂可用于饲养场动物（见EEC指令86/469/EEC）。可食组织中天然类固醇最大允许含量尚未确定（1993.8）。
1 主题内容
本分析方法描述了存在于牛尿样品中多种合成剂各个分析组分的检测。实验工作是按照残留指令（86/469/EEC）进行的，该法在法国应用。 2 应用范围 本法用于完成尿样常规筛选分析。 该法适用于测定： 睾丸素*（testosterone） 去甲雄三烯醇酮*（trenbolone） 雌二醇*（oestradiol） 雌三醇（oestrone） 玉米赤霉醇（zeranol）
顺式、反式己烯雌酚（cis- and trans- diethylstilboestrol）
己雌酚（hexoestrol）
双烯雌酚（dienoestrol）
19-去睾酮*（19-nortestosterone）
甲基睾酮（methyltestosterone）
乙基睾酮（ethinyltestosterone）
boldenone
双氢睾酮（stanolone）
炔诺酮（norethandrone）
去氢甲睾酮（dianabol）
甲睾酮（bolasterone）
α-氯睾酮（α-chlorotestosterone）
氯甲烷二烯酮（chloromethandienone）
乙烯雌二醇（vinyloestradiol）
炔雌二醇（ethinyloestradiol）
6α-甲基-17α乙基孕酮（medroxyprogesterone）
氯化孕酮（chlormadinone）
甲地孕酮（megestrol）
*17α-羟基或17β-羟基化合物。
大多数激素化合物的检测限约为1μg/L。

3 参考文献
Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.〔OJ.L.118, 14.4.93. pp 64-74〕.
ISO Standard 78/2-1982 Layout for standards-part 2: Standard for Chemical Analysis.

LeBizec, B., Montrade, M-2, Monteau, F.and Andre, F.(1993), Detection and identification of anabolic steroids in bovine urine by gas chromatography-mass spectrometry. Anal. Chim. Acta., 275，123-133.

LeBizec, B., Montrade, M-2, and Andre, F.(1993), Method of detection and identification of anabolic steroid agents in urine by gas chromatography-mass spectrometry in the electron impact mode. Document. LDH/93/02., Lab. Dosages Hormonaux. Nantes. ,France.

4 定义
所测得的人工合成激素物质含量意为：根据所叙述的方法测定，并且牛尿中人工合成激素物质的量以人工合成激素μg/L实验样品表示。 5 原理
本法包括6个步骤； ——在醋酸缓冲液中水解尿样。 ——C18小柱提取。 ——碳酸缓冲液洗涤。 ——在硅胶60柱上洗脱anabolic。 ——衍生化。
——GC/MS（EI）检测。
6 材料
注：已知所列引证来源的试剂是令人满意的，尽管如此，其它来源的试剂可能等同适用。除非另有规定，试剂均为AR级。 6.1标准物质和标准溶液 下列类固醇是从Steraloids公司(Wilton,USA),公司(,USA)和Reseavch Plus 公司(Bavonne,USA)得到的； 睾丸素*（testosterme） 去甲雄三烯醇酮*（trenbolone）
雌二醇*（oestradiol）
雌三醇（oestrone）
玉米赤霉醇（zeranol）
顺式、反式己烯雌酚（cis- and trans- diethylstilboestrol）
己雌酚（hexoestrol）
双烯雌酚（dienoestrol）
19-去睾酮*（19-nortestosterone）
甲基睾酮（methyltestosterone）
乙基睾酮（ethinyltestosterone）
boldenone
双氢睾酮（stanolone）
炔诺酮（norethandrone）
去氢甲睾酮（dianabol）
甲睾酮（bolasterone）
α-氯睾酮（α-chlorotesterone）
氯甲烷二烯酮（chlormadinone）
乙烯雌二醇（vinyloestradiol）
炔雌二醇（ethinyloestradiol）
6α-甲基-17α乙基孕酮（medroxyprogesterone）
氯化孕酮（chlormadinone）
甲地孕酮（megestrol）
*17α-羟基或17β-羟基化合物。 6.1.2 内标 氚标记的甲基—睾酮(Deuterated (d3) methy1-testosterone) ()。 氘标记的17β-雌二醇 (Deuterated (d2) 17β-oestradiol) ()。 6.1.3 外标 二氯苯 (Aldrich) 炔诺孕酮(Norgestrel) ()
6.2 化学试剂
6.2.1 甲醇
6.2.2 超纯水（＞18MΩ cm）
6.2.3 正已烷
6.2.4 Helix Pomatia 汁（β-glucuronidase-arylsulfatase，Merck-4114）
6.2.5 碳酸钠 6.2.6 氢氧化钠 6.2.7 醋酸钠 6.2.8 冰醋酸
6.2.9 乙酸乙酯
6.2.10 无水乙醇
6.2.11 硅胶 60
6.2.12 氮(通过硅胶干燥)
6.2.13 1，1，1—三氯乙烷
6.2.14 N—甲基—N—三甲基硅烷三氟乙酰胺：MSTFA
(N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide:MSTFA)(Fluka-69482)
6.2.15 三甲基碘硅烷：TMIS (Trimethyliodosilane:TMIS)(Fluka-58118)
6.2.16 二硫苏糖醇：DTE(Dithiothreitol:DTE)(Aldrich-15046-0)
6.2.17 N—甲基—N—(叔丁基甲硅烷)二氟乙酰胺：MTBSTFA
(N-methyl-N-(tertbutylmethylsilyl)trifluoracetamide:MTBSTFA)(Pierce-48920)
6.2.18 T.H.P 氦(Carboxyque)
6.3 溶液
6.3.1 2mol/L醋酸盐缓冲液，pH 5.2±0.2，用于共轭水解。溶解164g醋酸钠 (6.2.7)于900mL水(6.2.3)中，用冰醋酸(6.2.8)调节pH至5.2±0.2。用水定容至1L，在4℃下储存。最多使用一个月。
6.3.2 10%碳酸钠溶液：溶解100g碳酸钠于1L水中。
6.3.3 洗脱液
6.3.3.1 洗脱液1：甲醇/乙酸乙酯30/70
6.3.3.2 洗脱液2：1.1.1-三氯乙烷/醋酸乙酯80/20
6.3.3.3 洗脱液3：1.1.1-三氯乙烷/醋酸乙酯20/80
6.3.3.4 衍生化溶液：在无水条件下制备MSTFA(6.2.14)/TMIS(6.2.15)/DTE(6.2.16)溶液，100/5/5(V/V/W)。在避光、防潮下冷冻储藏。