主题：【原创】蛋白质纯化技术简述

蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
一般纯化蛋白之前都是样品的处理，有很多种不同来源的蛋白。例如：从植物提取，从动物组织提取，或者血清中。这些基本都是天然蛋白。目前，一般研究的蛋白都是实验室发酵培养的。
  微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

例如：大肠杆菌或者酵母发酵。在获得到到大体积的发酵液或者细胞破碎液后，首先需要离心。对于直接发酵液处理相对比较容易一些，只需要离心去掉培养菌就可以了，5000rpm基本上就够了。对于细胞破碎液离心力要求高一些，一般10000rpm。可能部分实验室条件比较好，有比较大的离心机，1L,4L或者更大的，这样相对比较轻松些。但是有些条件相对比较差一点就麻烦一些，可能一次离心仅200ml。

通过离心获得的上清液需要立即放到4度保温，否则培养菌容易再次大量生长。

关于细胞破碎的方法

 
1、超声波处理法：此方法为目前实验室研究最常用的方法。
用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

　无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

植物组织蛋白质提取方法 (summer)

三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片 
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 
药品：
提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 
裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的 DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

但是，蛋白质提取时的一点小注意



一、水溶液提取

　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（4度4）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。


1、pH值
　　蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 

2、盐浓度
　　稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。


二、有机溶剂提取 

　　一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

学习了！谢谢

蛋白质提取后，很重要的环节就是浓缩了。因为，提取后的蛋白浓度往往都是很低的，而且体积也很大，直接进行下一步的分离纯化不大现实。

现介绍几种常用的浓缩技术：

（一）透析袋浓缩法

利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），扎口，把高分子聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。

（二）冷冻干燥浓缩法 
  这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥

（三）超滤膜浓缩法

    此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入可离心的膜管中，通过离心力将液体渗透出，蛋白质则被截留住。

主要依据蛋白质分子量选择一定孔径的膜。目前常规的有截留分子量为3000，10000，50000，100000等多种。

    此种浓缩方法由于方便，快捷，因此实验室基本上都采用此种浓缩方法。
目前，市场上此类产品做得最好的应当属milipore。

型号一，主要用于以升为单位的体积浓缩



型号二 ，利用气压式，主要用于以ml为单位体积的农速



型号三，利用离心力作用。主要用于ml以下

补充一些超滤膜的相关资料

    膜技术是一门崭新的跨学科实用技术，膜分离过程是一种无相变、低能耗物理分离过程，具有高效、节能、无污染、操作方便和用途广等特点，半个世纪以来，膜技术已在许多领域中得到广泛地应用，被公认为是当代最有前途的高新技术之一，超滤膜从20世纪90年代得到广泛应用。
    超滤是介于微滤和纳滤之间的一种膜过程，平均孔径在3-100nm之间。超滤膜技术是一种能够将溶液进行净化、分离、浓缩的膜分离技术。其截留机理主要是筛分作用，但有时膜孔径既比溶剂分子大，又比溶质分子大，故膜表面的化学特性（膜的静电作用）也起着截留作用。以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的压力下，当水流过膜表面时，只允许水及低分子量溶质通过，从而达到溶液的净化、分离、与浓缩的目的。

超滤膜包一般均可反复使用， 因此摸索适合的膜包清洗、保存及消毒方法是保证产品质量、延长膜包寿命的重要环节。


完整性检测      一般在超滤器使用前 （清洗后）产品滤过完成后，
                推荐对超滤膜包进行完整性检测，以确认膜包的
                完整性，保证滤过产品质量。

 


使用前：        超滤膜出厂时均含有保湿剂，以保持膜包性状的稳
                定请在使用前用蒸馏水或缓冲溶液冲洗。

使用后：        可根据情况选择以下溶液进行清洗0.1-0.5N NaOH；10-60分钟。


保存            超滤膜包必须在下列溶液中湿态保存：0.05-0.1N NaOH；
                15%甘油+0.05%
                叠氮化钠，最佳保存温度4-15℃，最高25℃，最低4℃。
                实验室常用20％乙醇浸泡保存

消毒            超滤膜不可高温高压灭菌，如有必要可使用70%的酒精
                或200ppm的次氯酸钠杀菌。