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主题：【原创】“极限体验”之应用月旭C18柱摸索某中药复方中槲皮素的含测条件

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lingshike
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发表于：2010/02/08 15:39:23 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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应用月旭C18柱摸索某中药复方中槲皮素的含测条件



一.样品分子结构

槲皮素，3,3'',4'',5,7-五羟基黄酮，英文名  Quercetin ，分子式如下：




二.样品来源

某中药复方拟制成颗粒剂，我们将其中含有的一种与复方中药作用一致的化学成分作为工艺指标。查阅资料后得知，其中一味药材田基黄含有槲皮苷、槲皮素等化学成分，具有与复方相似的药理作用。于是，我们将槲皮苷、槲皮素作为工艺指标。

样品处理为：直接取药材提取液，10000r/min离心10min后，注入高效液相色谱仪。

色谱条件：Agilent1100（四元泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器），月旭XB-C18，5μm，4.6*250mm，柱温30℃，流速1ml/min,流动相为甲醇：0.1%磷酸（38：62）检测波长为254nm，进样量：10μl。

前期的试验，我们一直做槲皮苷，但是在它的后面一直有一个小峰，无论是改变流动相比例还是更换流动相，其分离度始终达不到1.5以上。于是，我们改做槲皮素。见下图：




三.槲皮素方法条件

    样品处理方法同上，改变流动相比例调整槲皮素出峰时间。

    流动相比例为：甲醇：0.1%磷酸（50：50），其他色谱条件同上。出峰时间为13min。见下图：




流动相比例为：甲醇：0.1%磷酸（48：52），其他色谱条件同上。出峰时间为17min。见下图：




上述两个流动相条件，经对比分析，甲醇：0.1%磷酸（50：50）时，少数样品的分离度比1.5稍小，而甲醇：0.1%磷酸（48：52）时，分离度达到1.5以上，由此选定流动相为甲醇：0.1%磷酸（48：52）。

然后比较了两个检测波长，槲皮素对照品在二极管整列检测器得到的3D图谱中，254nm和360nm都有较大吸收，这两个波长下样品图谱比较如下：

检测波长：254nm



检测波长：360nm




由上述两图可以看出，检测波长360nm的峰型比254nm的峰型好，检测波长选择360。

上述样品是取提取液离心后直接测定，峰面积较少，查阅资料后，对样品进行水解。测定图谱如下：



通过上述试验，可以得出此中药复方中槲皮素饿含测条件为：Agilent1100（四元泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器），月旭XB-C18，5μm，4.6*250mm，柱温30℃，流速1ml/min,流动相为甲醇：0.1%磷酸（48：52）检测波长为360nm。

样品经水解后离心上样，进样量：10μl。

月旭柱使用心得：我们这根月旭柱是2009.5从老板手上拿到的。到现在用了8个月了，总体而言，还不错。但是有一点，柱压有点偏高。我们拿到新柱子后，就用奈测试过，那时检测报告上甲醇：水（75：25）是120bar，我们做的时候是140bar，我们问过销售人员，他解释说是柱内填料结实所致。后来，随着我们的使用时间延长，相同的流动相，甲醇：0.1%磷酸（48：52），柱压一次比一次高。刚开始是170bar，后来就是220bar，问销售人员，怀疑柱子被堵，0.2ml/min甲醇反响冲60min，再顺接，纯甲醇，1ml/min，85bar，他说正常了。现在我们还是用甲醇：0.1%磷酸（48：52），刚开始会上到220bar，然后缓慢降到190bar。保留时间、峰面积，都还稳定，就是压力偏高。


我手上有三根月旭柱，身边还有几个同学在用月旭柱，感觉都还不错，有一个同学买的普通的C18柱，流动相用的是乙腈：磷酸缓冲盐（pH8）（5：95）有一个月的时间，每次用完后，洗四个小时的柱子，压力一直较稳定，结果还行。
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土老冒豆豆
tulaomaodoudou
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2010/2/8 17:53:08 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
看了楼主的详细分析。换了柱子后也调整了流动相，分离度达到了。但是注意哦，分离度达到可能是真的两组份之间分离度分开了，也有可能是柱子的分离效果不行，导致后面的小峰根本没分离出来。
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可爱宝贝
xiaoguodong
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2010/2/8 20:39:47 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
新建一个检测方法真不容易啊，学习了
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小卢
luxw
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2010/2/9 12:30:47 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.楼主提到压力高，除了柱子污染外，还与你的流动相粘度和流速有关，楼主可以适当调节一下
2.看楼主做的是中药，分离还满意，不错！不知道楼主使用中是否用保护柱了没？
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cceastman
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2010/2/9 16:47:19 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
真的不错啊，顶一个
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plexu
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2010/2/9 21:18:56 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
对同一根色谱柱，柱压会随温度、流速和流动相组成的变化而发生较大的变化。我们测试过一根Ultimate XB-C18，4.6x100mm,5um的色谱柱，在测试温度是25摄氏度，测试流速1ml/min的固定情况下，纯甲醇流动相下，柱压是52bar；75/25甲醇/水时是107bar；55/45甲醇/水时往往柱压是最大的，测得结果是134bar。
楼主使用的柱子是25厘米的，流动相条件是48/52甲醇/水（和柱压最大时的流动相组成非常接近），如果用了8个月后，柱压还能稳定在190bar附近，应该是可以接受的，上面测试的10厘米柱长的新柱子都有134bar的压力哦。

其实柱压只要没有大到仪器不能承受的水平，偏大一点并没有多大问题，现在国产的普通液相仪器也能最大承受300bar以上的柱压，而超高压UHPLC仪器则最大可承受1000bar以上了。
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Last edit by plexu
wqm321
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2010/2/10 9:59:21 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
文章还算受用，有一些疑问：
1.槲皮素或苷最好有标品图。
2.在复方里起作用的应该是苷，如果一定要测苷，摸索条件的时候，柱子也是可以换的。
3.苷水解后即是素，所以，费了很大周折，其实只需早一点查到这点信息，直接做素就可以了。
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棋笼千割
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2010/2/10 15:13:52 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
很辛苦的一个工作，顶啊
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东风恶
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2010/2/11 0:35:32 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
柱压高是月旭色谱柱的通病，建议增加相应的柱温可以改善的，如升高到40℃等。
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xiaomer2
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2010/2/11 12:05:00 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最头疼中药的分析了
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小卢
luxw
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2010/2/11 23:00:47 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 plexu(plexu) 发表:
对同一根色谱柱，柱压会随温度、流速和流动相组成的变化而发生较大的变化。我们测试过一根Ultimate XB-C18，4.6x100mm,5um的色谱柱，在测试温度是25摄氏度，测试流速1ml/min的固定情况下，纯甲醇流动相下，柱压是52bar；75/25甲醇/水时是107bar；55/45甲醇/水时往往柱压是最大的，测得结果是134bar。
楼主使用的柱子是25厘米的，流动相条件是48/52甲醇/水（和柱压最大时的流动相组成非常接近），如果用了8个月后，柱压还能稳定在190bar附近，应该是可以接受的，上面测试的10厘米柱长的新柱子都有134bar的压力哦。

其实柱压只要没有大到仪器不能承受的水平，偏大一点并没有多大问题，现在国产的普通液相仪器也能最大承受300bar以上的柱压，而超高压UHPLC仪器则最大可承受1000bar以上了。

这些研究都是财富啊!plexu作了很多工作啊!
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