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主题：【原创】极限体验之齐墩果酸保留时间大转移

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发表于：2010/04/18 18:47:44 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被samanthalas设置为精华；

重赏之下，必有莽夫！前段时间，本人做一中药复方中齐墩果酸的含测条件摸索，因为方法和操作的错误，导致了保留时间的大转移。实验做了三天才有点道道。下面一一给大家介绍。（唉，本人的实验能力还是太差了，学习啊。）

一.样品分子结构

齐墩果酸，CAS号：508-02-1 熊果酸，CAS号： 77-52-1

它们两个是同分异构体。出峰顺序为：齐墩果酸，熊果酸。

二.样品来源

某中药复方颗粒剂，君药中含有齐墩果酸等化学成分，具有与复方相似的药理作用。于是，我们拟对齐墩果酸的含测条件进行摸索。

样品处理为：取药材60%、70%、80%、92%、95%的醇提取液，水浴蒸干，加甲醇定容；取颗粒甲醇超声的续滤液，分别10000r/min离心10min后，取上清液注入高效液相色谱仪。

齐墩果酸对照品来源于中国药品生物制品检定所。

三.色谱条件：

Agilent1100（四元泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器），月旭XB-C18，5μm，4.6*250mm，伊利特ODS2，5μm，4.6*250mm，柱温25℃，流速1ml/min,流动相为甲醇：0.1%磷酸（80：20）检测波长为210nm，进样量：10μl。

色谱条件一共摸了三天，下面一一给大家介绍。

齐墩果酸保留时间大转移（第一天）

查阅资料得知，有人曾做过君药中齐墩果酸的含测。我们就先采用他的方法。

甲醇：0.1%磷酸80：20。1ml/min。25℃。210nm。10μl。

我们先用月旭柱，XB-C18，5μm，4.6*250mm。

先随便找了一个以前师兄师姐配的齐墩果酸对照品，浓度未知，连续进了两针，图谱如下：

图1

图2

两针在30min内结束分析，在8分多钟的时候，都有一个峰，后面8至30分钟就没有较大的峰出现，资料显示，对照品是在10分钟后出峰的。于是，我们误以为对照品有问题，就自己配制对照品。期间，进了一针样品。图谱如下：90%醇提样品。

图3

用自己配制了对照品溶液。0.7mg/ml。重新进样，连续两针对照品，图谱如下：

图4

图5

这个时候，问题就来了，上述两针对照品，图谱不一样。图4和图1、2是一致的。在图5中，30分钟出现一个较大的峰，我们误以为这就是对照品的峰。至于图4、5的异样之处，没有关心。于是马上又进了一针样品，图谱如下：90%醇提样品。

图6

图6中，在29,31分钟有峰（其实不是齐墩果酸和熊果酸的峰），但是峰面积太小。因时间原因，第一天的摸索结束。

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2010/4/18 18:59:08 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

齐墩果酸保留时间大转移（第二天）

色谱条件：甲醇：0.1%磷酸80：20。1ml/min。25℃。210nm。10μl。同第一天。

我们先仍用月旭柱，XB-C18，5μm，4.6*250mm。

跑基线的时候顺便进了一针自己配的齐墩果酸对照品（0.7mg/ml）

图7

基线平了之后，再进一针自己配的齐墩果酸对照品（0.7mg/ml）。图谱如下：

图8

很明显，图8与第一天的图6，完全不一样，怎么回事？难道是柱子问题？于是拿了一根新的月旭柱XB-C18，5μm，4.6*250mm，马上测柱效，没问题通过，就按照上述色谱条件跑基线，跑自己配的对照品（0.7mg/ml），连续两针。图谱如下：

图9

图10

图9和图10连续两针的图谱又不一样？怎么回事？难道是又是对照品？马上去别的老师那里拿了一个齐墩果酸的对照品（0.3mg/ml），用新柱子又进一针，图谱如下:

图11

这一针的峰很多，但是27分钟的时候那个峰，与第一天的图5中那个30分钟的峰接近，于是，我们误以为，这个27分钟的峰就是对照品，图9、10，也是我们自己配的对照品（0.7mg/ml）有问题所致。接着进了一针样品：92%醇提液

图12

样品还是很多的峰，27分钟有一个峰，但是很低很低。

我们用借到一根大连伊利特ODS2，5μm，4.6*250mm的柱子，按照上述的条件，用它跑了一下对照品和样品。图谱如下：

借到的齐墩果酸对照品(0.3mg/ml)

图13

92%醇提液

图14

自己配的齐墩果酸对照品（0.7mg/ml）

图15

通过图13和15可以看出，对照品的出峰时间为39-40min，证明我们自己配的对照品是没有问题的。样品中（图14）齐墩果酸含量很少。如此说来，对照品应该有峰，那月旭柱为什么出峰那么奇怪呢？要么不出峰，要么保留时间不一致。

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2010/4/18 19:18:42 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

齐墩果酸保留时间大转移（第三天）

色谱条件：前两天，我们按照文献用甲醇：0.1%磷酸80：20。1ml/min。25℃。210nm。10μl。月旭柱，XB-C18，5μm，4.6*250mm。效果不好（先暂且这么说）。而且，检测波长接近紫外末端，于是，我们改选用乙腈和磷酸。按照乙腈的洗脱能力强于甲醇，于是我们选择色谱条件：乙腈：0.1%磷酸60：40，25℃。210nm。旧的月旭柱，XB-C18，5μm，4.6*250mm。

我们先跑了自己配的0.7mg/ml的齐墩果酸对照品，连续两针，图谱如下：

图16

图17

两针的图谱在17分钟的地方有个峰，但是也太低了吧。进一针借到的齐墩果酸对照品（0.3mg/ml），图谱如下：

图18

上面三张图不一样？又怎么了？再进两针自己配的0.7mg/ml的齐墩果酸对照品，图谱如下：

图19

图20

图谱越来越乱了，到底是怎么了，我得罪谁了，天啊！

又配了一个新齐墩果酸对照品（0.656mg/ml）进了一针，图谱如下：

图21

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2010/4/18 19:29:14 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

到了这针，事情发生了转机。我仔细了看了前面两天和今天的记录，心里想不可能啊，怎么会怎么乱？！无意间，我闪过一个念头，会不会是我流动相不合适，虽然相同的条件，别人做的出来，但是我的柱子不一样啊，上一针的峰，残留到了下一针，更或者是下下针呢？于是马上进行计算。

前面两天和今天所有的峰都是连续进的，时间是连续的。假设所有的对照品进样都有较大的峰出现，那么今天第一针对照品的峰（图16），应该就是到了第三针里面（图18）的32min。那么它的保留时间就是，今天第一针的分析时间，加上第二针的分析时间，再加上第三针出峰的32min。结果就是：35+28+32=95min。按照这个时间，推算第二针对照品的峰应该是在第四针的30min左右（95-28-42=30），结果是在第四针的27min出了一个峰（图19）。那第三针对照品的峰应该是在第五针的9min左右（95-42-44=9），结果确实是在第五针的9分针出了一个峰！（图20）。以此类推，今天所做对照品都可以找到对应的峰。为再次证实推论的正确，再次进样新齐墩果酸对照品（0.656mg/ml），图谱如下：

图22

这一针证实了上述推论的正确性。图22中36min的峰是上针对照品（图21）的对应峰，而98min的峰才是本身进样的对应峰。

按照这个推论，对前面两天的奇怪现象进行计算。果然，与今天的结论是一样的，都是当针的对照品峰转移到了下针，或者下下针。经计算，第一天对照品的出峰时间应为76min左右。第二天中旧月旭柱的出峰时间为75min左右，新月旭柱的出峰时间为81min左右。

到此，所有的奇怪现象全部可以找到解释了。看来这个世界真的没有鬼。呵呵。

鉴于保留时间太长，前面奇怪现象的原因又找到了，于是，马上调流动相，进行样品的含测。

色谱条件：乙腈：0.1%磷酸90：10，1ml/min。30℃。210nm。10μl。

图23对照品图谱

色谱条件：乙腈：0.1%磷酸85：15，1ml/min。30℃。210nm。10μl。

图24对照品图谱

色谱条件：乙腈：0.1%磷酸80：20，1ml/min。30℃。210nm。10μl。

图25对照品图谱

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2010/4/18 19:32:51 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

图26 70%醇提液

图27 92%醇提液

色谱条件：乙腈：0.1%磷酸75：25，1ml/min。25℃。210nm。10μl。

图28颗粒超声样品

色谱条件：乙腈：0.1%磷酸70：30，1ml/min。25℃。210nm。10μl。

图29颗粒超声样品

通过调整流动相，齐墩果酸的保留时间从10min推移至40min，但都是分不开的。后面我们放弃了这个成分的测定。

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2010/4/18 19:33:34 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

通过这个试验，我进行总结如下：

1. 试验一开始就错了，后面跟着错了两天，应该在对照品没有出峰的情况下，马上调流动相。一般对照品是不可能不出峰的。

2. 试验流动相得调整，应该从极性小开始往极性大调（C18柱）。（这一点，我们论坛里面早就有了，可惜，我没有看到，zxhcnf等高手早这么做了。 http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20100107/2326822/）

3. 齐墩果酸和熊果酸是同分异构体，液相分离很难。就算偶尔可以分开，重复性也是很差。我遇到过的人都说很难很难。这一点，不知道大家有什么经验没有，可以讨论讨论。

4. 这个试验中，我们用了月旭XB-C18，5μm，4.6*250mm，伊利特ODS2，5μm，4.6*250mm，两根柱子，从保留时间和柱压来看，月旭XB-C18均大于伊利特ODS（保留时间，月旭75-81min，伊利特ODS 40min；柱压，旧月旭153bar，新月旭柱120bar，伊利特ODS108bar。）这个说明月旭柱的填料确实很结实。从分离效果来看，齐墩果酸和熊果酸两根柱子都没有分开，不过这个本来就是一个分离难题。

5. 因为月旭柱填料比较结实，在查阅文献的资料中，要注意柱子的厂家型号，如果要用月旭柱重现文献的图谱，建议流动相的极性要小于文献记载（C18柱）。

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