3.荧光PCR
荧光PCR不同于其他PCR的地方在于PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化,荧光信号变量与扩增产物变量成正比,并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的。主要有以下几类:
1) 荧光染料直接结合扩增产物 如SYBB Green I,类似于EB,能特异性地区分单双链DNA,只与双链DNA结合.
2) 荧光标记引物对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物.
3) 荧光标记探针常规引物以外,引入荧光基团标记的特异性探针,探针可与模板发生一对一结合关系。
a) Taqman双标记探针(TaqmanTM 5-nuclease assay)
b) 分子信标探针(Molecular beacon TM)
c) LightCycler TM杂交双探针
荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强,避免了非特异性扩增造成的假阳性信号。匹基生物开发的荧光PCR检测试剂盒主要基于Taqman技术 (TaqmanTM 5-nuclease assay):除常规的一对引物以外,PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团,3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团(发生FRET),因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号.但当溶液中有模板时,模板变性后低温退火时,引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换: Taq酶的5—3’外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光,切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量