主题：【分享】 本周主打——紫外分光光度计的使用原理和方法

紫外-可见分光光度法(ultraviolet-visible spectrophotometry, UV-VIS)
它是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析, 所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中特定波长的光而产生的吸收光谱。
按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法和可见分光光度法，合称为紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法的特点：
1  与其它光谱分析方法相比，其仪器设备和操作都比较简单，费用少，分析速度快;
2  灵敏度高;
3  选择性好
4  精密度和准确度较高;
5  用途广泛。

§1. 紫外-可见吸收光谱
1.  物质对光的选择性吸收物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础。

通过测定被测物质对不同波长的光的吸收强度（吸光度），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。如图3-1； 
        在吸收曲线中，通常选用最大吸收波长λmax进行物质含量的测定。
2  有机化合物的紫外-可见吸收光谱
2.1 有机化合物的电子跃迁
与紫外-可见吸收光谱有关的电子有三种，即形成单键的σ电子、形成双键的π电子以及未参与成键的n电子。
跃迁类型有：σ  σ*、n    σ* 、π  π *、
n    π * 四种。
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*，n→σ* 跃迁，吸收峰一般出现在真空紫外区，吸收峰低于200nm，实际应用价值不大。
   
    不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π* 跃迁，吸收峰一般大于200nm。
生色团：是指分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。人们通常将能吸收紫外、可见光的原子团或结构系统定义为生色团。见表3-1和3-2。
助色团：是指带有非键电子对的基团，如-OH、-OR、-NHR、-SH、-Cl、-Br、-I等，它们本身不能吸收大于200nm的光，但是当它们与生色团相连时，会使生色团的吸收峰向长波方向移动，并且增加其吸收强度。见表3-4。
红移和紫移
在有机化合物中，常常因取代基的变更或溶剂的改变，使其吸收带的最大吸收波长λmax发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3)，向短波方向移动称为紫移。

2.2  有机化合物的吸收带
吸收带(absorption band):  在紫外光谱中，吸收峰在光谱中的波带位置。根据电子及分子轨道的种类，可将吸收带分为四种类型。
(1)       R吸收带
(2)       K吸收带
(3)       B吸收带
(4)       E吸收带

3  无机化合物的紫外-可见吸收光谱
1. f电子跃迁吸收光谱
镧系和锕系元素的离子对紫外和可见光的吸收是基于内层f电子的跃迁而产生的。其紫外可见光谱为一些狭长的特征吸收峰，这些峰几乎不受金属离子的配位环境的影响。   
2. d电子跃迁吸收光谱
过渡金属的电子跃迁类型为d电子在不同d轨道间的跃迁，吸收紫外或可见光谱。这些峰强烈受配位环境的影响。
      例如 cu2+以水为配位体，吸收峰在794nm处，而以氨为配位体，吸收峰在663nm处。此类光谱吸收强度弱，较少用于定量分析。
3.  电荷迁移光谱    某些分子既是电子给体，又是电子受体，当电子受辐射能激发从给体外层轨道向受体跃迁时，就会产生较强的吸收，这种光谱称为电荷迁移光谱。如 苯酰基取代物在光作用下的异构反应。
1.4  影响紫外-可见吸收光谱的因素
物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。
1.温度  在室温范围内，温度对吸收光谱的影响不大。
2. 溶剂   
注意如下几点：

（1）尽量选用低极性溶剂；
（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。

3. pH值
1.5  紫外-可见吸收光谱的应用
紫外-可见吸收光谱除主要可用于物质的定量分析外，还可以用于物质的定性分析、纯度鉴定、结构分析。

1.定性分析

2.纯度的鉴定
    用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便的。
    如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析
        紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。
例如，某化合物在近紫外区内无吸收，说明该物质无共轭结构和芳香结构。

§2. 朗伯-比尔定律
一、吸光度和透光度
设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia,透射光强度为 It，反射光强度为Ir，则

                          I0= Ia+ It+ Ir

由于反射光强度基本相同，其影响可相互抵消，上式可简化为：
                       
                            I0= Ia+ It
透光度：透光度为透过光的强度It与入射光强度I0之比，用T表示：
                      即  T= It/I0
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示，
即
                        A=lg1/T=lgI0/It

二、朗伯-比尔定律
朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
                              A= κ cl
    式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l为透光液层厚度。
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理论基础。
三、吸光系数
当l以cm，c以g/L为单位，κ称为吸光系数，用 a表示。
A= a cl
a的单位为L/(g.cm)
摩尔吸光系数
当l以cm，c以mol/L为单位，κ称为摩尔吸光系数，用 ε表示。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 
      ε的单位为L/mol.cm，它表示物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
比吸光系数
比吸光系数是指百分含量为1%， l为1cm时的吸光度值，用          表示。

四、偏离朗伯-
四、偏离朗伯-比耳定律的因素

未完待续。。。。。。。。。。

紫外-可见分光光度计操作规程
754紫外-可见分光光度计操作规程
用途：能在紫外、可见光谱区域对样品物质作定性和定量的分析。
波长范围：200nm-800nm。
操作要点：
3、插上电源，打开开关，打开试样室盖，按“A/T/C/F”键，选择“T%”状态，选择测量所需波长，预热30分钟。
4、开始测量时要先调节仪器的零点，方法为：
保持在“T%”状态，当关上试样室盖时，屏幕应显示“100.0”，如否，按“OA/100%”键；打开试样室盖，屏幕应显示“000.0”，如否，按“0%”键，重复2-3次，仪器本身的零点即调好，可以开始测量。
3、用参比液润洗一个比色皿，装样到比色皿的3/4处（必须确保光路通过被测样品中心），用吸水纸吸干比色皿外部所沾的液体，将比色皿的光面对准光路放入比色皿架，用同样的方法将所测样品装到其余的比色皿中并放入比色皿架中。
7、将装有参比液的比色皿拉入光路，关上试样室盖，按“A/T/C/F”键，调到“Abs”， 按“OA/100%”键，屏幕显示“0.000”，将其余测试样品一一拉入光路，记下测量数值即可（不可用力拉动拉杆）。
8、测量完毕后，将比色皿清洗干净（最好用乙醇清洗），擦干，放回盒子，关上开关，拔下电源，罩上仪器罩，并打扫卫生，才可离开。
9、本操作要点只针对测量吸光度而言。
注意事项：
7、仪器使用前需开机预热30分钟
8、开关试样室盖时动作要轻缓
9、不要在仪器上方倾倒测试样品，以免样品污染仪器表面，损坏仪器
10、一定要将比色皿外部所沾样品擦干净，才能放进比色皿架进行测定
11、有任何疑问请报告指导老师
12、使用完毕请认真填写《仪器设备使用登记簿》，并交指导老师签字。

753型紫外可见分光光度计操作规
1.向右推开试样室盖，开显示箱电源开关，波段选择开关置于"T"，调节"0％T"旋钮，使显示器为"0.000".(53WB型如显示P1，即"T"未调0)。
2.光源电气箱电源开关向上，指示灯亮，钨灯开关向上，指示灯亮，溴钨灯亮。氘灯开关向上，指示灯亮，点燃开关向下2～3秒后迅速拨向上，指示灯亮，氘灯点燃。
3.用波长手轮选择波长，到位时的手轮旋转方向要固定，使用波长在200～350nm范围内，将光源转换手柄置于"氘灯"处，在350nm～800nm范围内，将手柄置于"钨灯"处。
4.检查T－A转换的精度：将波段选择开关置于"T"，池架第一孔置于光路，调节"100→0"旋钮，使显示为"1.000"；53WB型如显示P2即参比未调至100％。开关置于"A"应显示"0.000"，若有偏差用小改锥调节侧面"0A"。同理将"T"调到"0.100"，"A"应显示为"1.000"，若有偏差调节"1A"。再检查T＝0.500时，应有A＝0.301。
5. 狭缝尽可能选用2nm，或者用4nm。
6.向右推开试样室盖，放入待测的参比杯和样品杯，参比杯必须放在池架的第一孔内。再将盖向左推回用拉杆将参比液推入光路，波段选择开关置于"A"，调节"100→0"旋钮。使显示值为"0.000"用拉杆将样品液推入光路，显示值即为被测样品的吸光度"A"。

UVPC操作规程
开机：
开机前确认电源是否连接、所连电脑是否开机；
打开仪器电源开关；
双击电脑桌面上UVPC图标或在开始菜单中找到UVPC图标并打开，等待仪器自检。
使用：
仪器自检结束后，在菜单“Acquire Mode”（测定模式）下选中所需的测定方式：“Spectrum”（光谱扫描）、“Quantitative”（定量计算）及“Time Course”（时间曲线扫描）。
1.Spectrum（光谱扫描）：
1.1 调节参数：
在菜单“Configure”中选中“Parameters”或用“Ctrl + P”调用参数表，选择所需参数。通常改动波长范围（Wavelength Range），修改扫描范围。点击“OK”，等待仪器调整至准备状态。
1.2 调整基线：
在样品槽及参比槽中放入调整基线溶液的比色皿，盖好上盖，点击“Baseline”，待仪器自动调整基线。
1.3 扫描谱图：
将样品槽中的比色皿中溶液换成被测溶液，盖好上盖，点击“Start”，待仪器自动测试完毕。完毕时会自动出现“Save”状态，点击“Save”。再在菜单“File”中选中“Save”或用“Ctrl + S”，将该光谱图存入所需位置及名称。
2.Quantitative（定量计算）：
2.1 调节参数：
在菜单“Configure”中选中“Parameters”或用“Ctrl + P”调用参数表，选择所需参数。通常修改测定波长值（Wavelength）。如需绘制标准曲线，可再选中“Concentration”项，修改其中的浓度单位，如：g/dl、mg/ml等；在测定范围中输入测定范围值，如0到100。如果样品做重复点，可在“Repetitions”项中选中重复数（但可选重复数不大于5）。点击“OK”，等待仪器调整至准备状态。
2.2 绘制标准曲线：
选中“Standard”项，至标准品测定状态。在样品槽及参比槽中放入调整基线溶液的比色皿，盖好上盖，点击“Auto Zero”。再将样品槽中的比色皿中溶液换成被测溶液，盖好上盖，点击“Read”，会自动出现“Edit Standard”状态，在浓度项“Concentration”中输入该溶液的浓度值。点击“OK”，仪器会自动记录并等待下一个标准品的测定。更换样品池中的标准品并遂一测定至全部标准品测定完毕。在菜单“File”中选中“Save”或用“Ctrl + S”，将该标准曲线存入所需位置及名称。
如用以前绘制的标准曲线，可在菜单“File”中选中“Open”或用“Ctrl + O”，将所要调用的标准曲线打开。注意文件类型“List Files of Type”；如需查看该标准曲线的参数，在“View Parameters”项前方框中打钩，就可以看到该标准曲线的参数。
2.3 测定样品：
选中“Unknown”项，将样品槽中的比色皿中溶液换成被测溶液，盖好上盖，点击“Read”，仪器会自动记录测定吸收值，同时根据标准曲线计算出对应的浓度值；仪器会自动等待下一个样品的测定。遂一更换样品池中的样品并测定至全部样品测定完毕。在菜单“File”中选中“Save”或用“Ctrl + S”，将该样品结果存入所需位置及名称。
3.Time Course（时间曲线扫描）
3.1 调节参数：
在菜单“Configure”中选中“Parameters”或用“Ctrl + P”调用参数表，选择所需参数。通常改动测定波长值（Wavelength）：修改测定波长；反应时间（Reaction Time）：修改反应时间；单位（Units）：可选小时、分钟或秒（默认的是秒）。点击“OK”，等待仪器调整至准备状态。
3.2 调整零点：
在样品槽及参比槽中放入调整基线溶液的比色皿，盖好上盖，点击“Auto Zero”。
3.3 扫描谱图：
将样品槽中的比色皿中溶液换成被测溶液，盖好上盖，点击“Start”，待仪器自动测试完毕。完毕时会自动出现“Save”状态，点击“Save”。再在菜单“File”中选中“Save”或用“Ctrl + S”，将该光谱图存入所需位置及名称。
关机：
1.将比色皿中的溶液到尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，将比色皿保存在保存液中；将仪器外盖盖好。
2.退出UVPC操作系统，关闭UVPC仪器。
注意事项：
1.测定紫外波长时，需选用石英玻璃的比色皿。
2.如要对光谱图进行加减乘除、求导求对数、顶点及定点得数据、峰面积得计算等，在菜单“Manipulate”下处理。
3、测定时，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。
问题处理：
1、如果仪器不能初始化，关机（电脑及UVPC）重启；如不成功，查看说明书；
2、如果数据或谱图波动大，依次检查：调零是否正确（重新调零）、狭缝宽度是否过窄（加大狭缝宽度）、参比样值是否过大（如果吸收值大于2.0，可能会出现波动大）、光源是否有误（必要时，更换光源）。
3、如果基线不能平整，依次检查：调零是否正确（重新调零）、扫描速度是否过快（改“Fast”扫描为“Medium”扫描或更低）、波长范围是否过窄（扩大扫描波长范围）、比色皿是否更换（如更换，则重新调零）。
4、如果吸收值异常，依次检查：波长设置是否正确（重新调整波长，并重新调零）、测量时是否调零（如被误操作，重新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波段时，要用石英比色皿）、样品准备是否有误（如有误，重新准备样品）。
1.向右推开试样室盖，开显示箱电源开关，波段选择开关置于"T"，调节"0％T"旋钮，使显示器为"0.000".(53WB型如显示P1，即"T"未调0)。
2.光源电气箱电源开关向上，指示灯亮，钨灯开关向上，指示灯亮，溴钨灯亮。氘灯开关向上，指示灯亮，点燃开关向下2～3秒后迅速拨向上，指示灯亮，氘灯点燃。
3.用波长手轮选择波长，到位时的手轮旋转方向要固定，使用波长在200～350nm范围内，将光源转换手柄置于"氘灯"处，在350nm～800nm范围内，将手柄置于"钨灯"处。
4.检查T－A转换的精度：将波段选择开关置于"T"，池架第一孔置于光路，调节"100→0"旋钮，使显示为"1.000"；53WB型如显示P2即参比未调至100％。开关置于"A"应显示"0.000"，若有偏差用小改锥调节侧面"0A"。同理将"T"调到"0.100"，"A"应显示为"1.000"，若有偏差调节"1A"。再检查T＝0.500时，应有A＝0.301。
5. 狭缝尽可能选用2nm，或者用4nm。
6.向右推开试样室盖，放入待测的参比杯和样品杯，参比杯必须放在池架的第一孔内。再将盖向左推回用拉杆将参比液推入光路，波段选择开关置于"A"，调节"100→0"旋钮。使显示值为"0.000"用拉杆将样品液推入光路，显示值即为被测样品的吸光度"A"。