主题：【分享】目前最流行的测定光合速率的方法

一、氧电极法测定氧气的释放

        氧电极法是通过测定离体叶片、细胞或叶绿体的光合放氧量来表示植物的光合速率。目前通用的是薄膜氧电极，由镶嵌在绝缘材料上的银极（阳极）和铂极（阴极）构成。电极表面覆以聚四氟乙烯薄膜，在电极与薄膜之间充以氯化钾溶液作为电解质，当在两极间加0.6～0.8V的极化电压时，透过薄膜进入氯化钾溶液的溶解氧便在铂极上还原，在银极上发生氧化反应，使电极间产生扩散电流，电流的大小与透过膜的氧量成正比。电极控制器将电极间产生的电流信号转换成单位时间、单位体积溶液（液相氧电极）或单位叶面积（气相氧电极）的放氧量，从而测得植物的光合速率。
      该方法只能测定离体组织的光合速率，测定时需要将叶片浸在含NaHCO3的溶液中，排除了气孔因素对光合作用的影响，因此，它测定的光合速率只反映了植物光合速率的最大潜力，无法反映植物处在自然环境中的实际光合速率。
      用氧电极研究植物的光合速率目前主要的产品有英国Hansatech科学仪器公司生产的Chlorolab系列及Oxygraph、 Oxytherm等型号的液相氧电极和Leaflab系列的气相氧电极，美国Yellow Springs仪器有限公司生产的YSI-53型生物氧监测仪等。

二、光合仪（红外线CO2分析仪）测定CO2的吸收

      光合仪应用红外线CO2分析仪测定光合过程中对CO2的吸收从而计算净光合速率。
      红外线CO2分析仪的原理：
      许多由异原子组成的具有偶极距的气体分子，如CO2、CO、H2O、SO2、N2O、NH3等，在波长2.5～25微米的中波段红外光区都有特异的吸收带，红外光经过上述气体分子时，与气体分子振动频率相等能够形成共振的红外光，便被气体分子吸收，使透过的红外光能量减少，被吸收的红外光能量的多少与该气体的吸收系数(K)、气体浓度(C)和气层的厚度(L)有关，并服从朗伯-比尔定律：
                E=EoeKCL
          式中：Eo-入射光能量；E-透射光能量。
      CO2在中段红外光区的吸收带有4处，吸收峰分别在波长2.69、2.77、4.26和14.99μm处，其吸收率分别为0.54%、0.31%、23.2%和3.1%。其中峰值为4.26μm的吸收波长最强，且不与H2O的吸收带重叠，而2.69和2.77μm的吸收带则与H2O的吸收相重叠。
      H2O吸收红外线的最大吸收峰值为2.59μm，同样的原理应用红外线技术可以准确地测量气体中水分的含量。
      因此，我们可以通过红外线CO2气体分析仪检测植物在光合作用过程中CO2的变化量来测得植物叶片的光合速率，测定H2O的变化量来测得植物叶片的蒸腾速率和气孔导度等相关参数。
      目前国产的光合仪不多而且多不易受到研究人员的青睐。进口的光合仪由于在稳定性、操作简单、准确性方面优于国产光合仪，现在进口光合仪成为光合速率研究中的首选。常见的光合仪有美国（原英国）PP Systems公司的CIRAS-2型便携式光合仪以及Licor公司的光合仪。

      现在随着科学研究的发展，仅仅测定光合速率，或者测定植物的光合日变化等已经不能达到发表文章的要求了。我们在实验中应用氧电极和光合仪提供的光合速率等重要数据来说明我们课题要解决的问题，为我们的研究提供真实可靠的资料。

光合仪和氧电极测定光合速率的区别及优缺点
目前最流行的测定光合速率的方法是通过测定CO2吸收的红外线CO2气体分析仪法（光合仪）以及通过测定O2释放的氧电极法。然而，究竟那一种方法测定准确，什么样的方法才是最适合自己实验的方法呢？
光合仪和氧电极测定光合速率的区别：
      用氧电极测定的光合速率要大于用光合仪测定的光合速率。
      根据光合作用的总反应式：
CO2 + 2H2O* + 4.69kJ → (CH2O) + O*2↑+ H2O
      无论用氧电极测定O2的释放还是用光合仪（红外线CO2气体分析仪法）测定CO2的吸收测定光合速率应该相同，然而实际情况并非如此。
      光合作用过程中每生成一个O2分子将会有四个电子进入电子传递链，经过电子传递体的电子传递过程，传递给NADPH，NADPH和ATP还原一个CO2分子，这种情况下是相等的。然而，电子经电子传递链后并非都将电子传递给NADPH。部分电子传给氧，进入米勒反应，还有部分电子用在氮（N）代谢和硫（S）代谢和光呼吸过程中，在逆境条件下用来非还原CO2的电子比例增加。因此，实际情况下并非是每释放一个O2分子就吸收一个CO2分子。
      再者液相氧电极测定O2的释放过程是在NaHCO3溶液中进行的，NaHCO3溶液提供饱和CO2，且消除了气孔限制对光合速率的影响。气相氧电极测定O2的释放也是在饱和CO2条件下测定，还有就是氧电极测定光合速率是在离体条件下测定。而光合仪（红外线CO2气体分析仪法）测定CO2的吸收，受到气孔和CO2浓度的限制，因此用光合仪和氧电极测定的光合速率的的大小是不一致的。一般来说，用氧电极测定的光合速率要大于用光合仪测定的光合速率。

光合仪和氧电极测定光合速率各自的特点
氧电极
      氧电极测定的光合速率不能真正反映植物在实际条件下的碳同化速率。但在某些研究中，人们需要知道植物的放氧速率，比较植物放氧和同化CO2速率的差异，从而了解光合电子在不同途径的分配情况。加入不同的抑制剂，可以研究光合电子传递途径，氧电极法除了可以测定光合速率外，还可以用于测定各种生物体及活性物质的耗氧或放氧反应，例如可以测定某些酶的活性及呼吸途径的研究，并且能够很好地控制反应条件。用氧电极测定光合速率可以消除气孔限制对光合的影响，为科研提供有力的数据支持。最重要的一点就是应用液相氧电极，可以测定一些光合仪不能测定的小的植物材料如藻类、苔藓类、浮游植物、悬浮细胞、芽、茎等的光合速率。
然而，作为光合速率的测定方法，氧电极法测定指标单一，不能测定气孔导度、蒸腾速率、CO2补偿点、CO2饱和点等光合作用重要参数。
      用氧电极研究植物的光合速率目前主要的产品有英国Hansatech科学仪器公司生产的Chlorolab系列及Oxygraph等型号的液相氧电极和Leaflab系列的气相氧电极。

光合仪
      很多刚入学的研究生会觉得光合仪就是测定光合速率，我当时也是这么想的，其实不然，光合仪有着广泛的用途。
      光合仪用来从事植物叶片光合作用、蒸腾作用、呼吸作用等相关研究。测量参数包括CO2浓度、净光合速率、蒸腾速率、胞间CO2浓度、气孔导度、大气湿度、空气温度、叶片温度、蒸汽压亏缺、大气压、光强、、Ci/Ca等，并且通过系统自带的自动测量程序测定植物的光—光合响应曲线、CO2—光合响应曲线、温度—光合响应曲线、湿度—光合响应曲线等各种响应曲线的测定，并且可以通过这些响应曲线计算出RuBP羧化效率、表观量子产量、光补偿点、饱和光强、CO2补偿点、CO2饱和点、温度补偿点、RuBP最大再生速率以及光合作用气孔限制值等一些非常有用的生理生态参数。通过对测定条件的控制我们还可以研究能量的分配以及光呼吸。
      目前被广泛使用的光合仪一般都采取开放式气路设计开放式气路系统采用双气室红外仪，使未经过同化室的气体作为参比气进入一个气室，使从同化室出来的气体作为样本气进入另一个气室，由红外监测器检测出参比气和样本气的CO2浓度差，根据其浓度差、同化室中叶片面积和气体流量计算出光合速率。由于该方法快速、准确，又弥补了密闭式气路系统的一些不足，所以应用越来越普及。
然而，光合仪由于受叶室类型的限制不方便测定藻类、苔藓类以及小的浮游植物，悬浮细胞、苹果果皮，幼芽等材料的光合速率。
        常见的光合仪有美国（原英国）PP Systems公司的CIRAS-2型便携式光合仪。

叶绿素荧光—光合作用研究和光能分配的探针（基础理论篇）

Kautsky和Hirsh（1931）最先认识到光合原初反应和叶绿素荧光存在着密切关系。他们第一次报告了经过暗适应的光合材料照光后，叶绿素荧光先迅速上升到一个最大值，然后逐渐下降，最后达到一个稳定值。此后，随着研究的深入，人们逐步认识到荧光诱导动力学曲线中蕴藏着丰富的信息。

No investigation into the photosynthetic performance of plants under field conditions seems complete without some fluorescence data.  ------- Giles N.Johnson

叶绿素荧光动力学包含着光合作用过程的重要信息，如光能的吸收和转化。能量的传递与分配、反应中心的状态，过剩能量的耗散以及反映光合作用的光抑制和光破坏。应用叶绿素荧光可以对植物材料进行原位、无损伤的检测，且操作步骤简单。所以叶绿素荧光越来越受到人们的青睐，在光合生理和逆境生理等研究领域有着广泛的应用。

叶绿素荧光产生的基本原理：

           

叶绿素分子吸收光能（激发能）后，由基态跃迁到激发态，激发态是不稳定的状态，就会再回到基态，电子由基态回到基态的过程中，大部分能量转向反应中心推动光化学反应及后来的电子传递光合磷酸化，固定。还原CO2最终将能量贮存在有机物中，一小部分能量以热的形式耗散，再有一部分能量以荧光的形式发出。这三者之间是此消彼长相互竞争的关系。因此我们可以用叶绿素荧光来研究光合作用的变化。

植物体内的叶绿素荧光诱导动力学曲线的测定可采用脉冲调制式荧光仪和连续激发式（非调制式）荧光仪两种不同的方法，它们各有不同的特点。

脉冲调制式荧光仪：

由于调制式荧光仪用来测量荧光的光源是调制脉冲光（高频率的闪光），植物发出的荧光信号与仪器光源发出的光可以区分开，所以用它可以在有背景光的情况下测定。常用的做法是，调制式荧光仪的测量步骤是，先打开测量光（measuring light），测暗适应叶片的最小荧光（FO），然后打开饱和脉冲光（saturating flash light）测暗适应叶片的最大荧光（FM），然后再开启作用光（actinic light）使所测材料受光而进行光合作用。当所测材料光适应后，开启测量光测光适应叶片的稳态荧光（FS），然后打开饱和脉冲光测光适应后的最大荧光（FM’），关掉作用光，打开远红光（far-red light）优先激发PSⅠ使PSⅡ电子传递体处于氧化状态，测定光适应叶片的最小荧光（FO’）（图2）。根据这些变数可以计算暗适应下PSⅡ的最大量子产额[FV/FM=(FM-FO)/FM]、光适应下PSⅡ的最大量子产额[FV’/FM’= (FM’-FO’)/FM’]、光适应下的PSⅡ反应中心开放的比例[qP=(FM’-FS)/( FM’-FO’)]、光适应下PSⅡ的实际光化学效率[ΦPSII=(FM’-FS)/FM’]（Genty等 1989）、光适应下的非光化学猝灭[NPQ=FM/FM’-1]（Demmig-Adams和Adams 1996）等。这些参数除了FV/FM反映了荧光诱导动力学曲线上升过程的O-P段外，其它都是反映P点之后的下降过程。由于光合作用的碳同化反应能反馈影响光合原初反应，调制式荧光仪主要通过测量光合作用的原初光化学反应的情况来反映光合作用的碳同化等反映启动后的光能捕获、转化及利用情况。而对于碳同化反应活化前PSⅡ的光化学变化，所获得的信息就很少了。由于时间分辨率及信噪比的限制，对于从O-P上升过程中荧光变化的信息量的获得，与连续激发式荧光仪相比，调制式荧光仪远不及前者。