以提高选择性为目标的新型分离技术
1 亲和萃取技术
在双水相萃取中将亲和配基藕联在成相聚合物上, 即成为亲和双水相萃取。Kamihira等应用亲和双水相萃取提纯蛋白质A , 将亲和配基IgG藕联在高分子Eudragit S100 上, 在双水相萃取过程中分布在上相。A 蛋白的纯度提高了26 倍, 达到81 % ,收率为80 %。在反胶团相中添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂(cosurfactant) , 即成为亲和反胶团萃取。Kelley等研究了亲和反胶团萃取的基础理论和技术。Paradkar和Choe等人分别将亲和反胶团萃取应用于过氧化酶(peroxidase) 和糖蛋白(glycoprotein) 的提纯。Sun Yan等研究了利用亲和反胶团萃取纯化卵磷脂的过程。Lazarova等试图将反胶团萃取和反萃过程合二为一。他们研究了α2淀粉酶的萃取过程, 采用阳离子表面活性剂CTAB , 研究了酶传质过程的动力学, 以及传质过程中酶活性的变化。
2 亲和膜分离技术
在膜材料上固定亲和配基, 使待分离物质与膜材料发生亲和作用来提高膜吸附性能而将其它组分选择性透过Dancette等将A 蛋白联接到膜上分离纯化IgG, 发现流速增大则吸附量减少; 进料浓度增大时, IgG优先吸附而非穿透。批式实验测定的吸附容量为616mg/ mL 膜体积。利用此亲和膜从发酵上清液中提纯IgG, 电泳检验未发现杂质。Zeng等应用亲和膜从麦芽胚中提取凝集素, 他们在壳多糖膜上引入N2乙酰2D2葡糖( GlcNAc)作为支撑介质和亲和配基, 制成的膜通透性好, 而且吸附容量可达180mg/ g 膜, 是球状壳多糖的20倍。分离结果得到了较高的纯度( > 99 %) 和收率(约50mg 凝集素/ 100g 麦芽胚) 。
3 置换色谱技术
在置换色谱( displacement chromatography) 中,置换剂(displacer) 和色谱介质的亲和力比所有待分离组分都强, 这样利用置换剂可以将吸附在柱上的组分按亲和力由弱到强的顺序依次洗出色谱柱。各组分洗脱峰可接近矩形, 比其他洗脱方式的分辨率高, 而且可以很好地实现待分离组分的浓Galaev总结了这一新技术在蛋白质分离过程中的应用, 用模拟体系和实际体系进行了实验, 并讨论了色谱柱再生的方法Freitag等制备了一系列可用作置换剂的共聚物, 而且这些共聚物可随温度的变化而可逆地溶解或不溶, 这样就可以很方便地进行置换剂的再生。Ramanan等使用一个反相色谱柱, 应用置换色谱来分离二元多肽混合物, 研究了置换剂种类的选择, 以及置换剂浓度、移动相流速等操作参数对分离效果的影响。
4 Smart Polymer
Smart polymer 对某些外界环境条件(如温度、pH、离子强度、电场) 敏感, 随外界条件的变化而可逆地溶解或沉淀。在Smart polymer 上耦联亲和配基, 便可使目标蛋白质随着smart polymer 沉淀或复溶。用这种方法可以直接从发酵液中提取目标蛋白, 省去了脱盐及粗分离等步骤, 条件温和且易于放大。常见的smart polymer 包括Eudragit S100 (pH降低时沉淀) 、聚N2乙烯己内酰胺和聚异丙基丙烯酰胺(均为水溶液加热至35~40 ℃或增加离子强度时沉淀) 等。将热敏smart polymer 与色谱介质藕联用于亲和色谱, 则可采用改变温度的方法来洗脱蛋白质。Agarwal等使用smart polymer 提纯β2葡糖苷酶, 纯化过程为:
Galaev等总结了smart polymer 在生物分离中的应用, 指出Smart polymer 及其在生物分离中的应用是目前特别值得关注的研究方向。
5 非水介质电泳
通过在水中引入有机溶剂形成非水介质体系,来改变蛋白质在电场下的电迁移率, 可以提高电泳的分离度和选择性; 非水介质电导率小, 具有低焦耳热的特性, 这有助于解决困扰大规模制备型电泳的散热问题; 同时许多难溶于水而易溶于有机溶剂的生物产品可以通过非水介质电泳实现分离。本实验室对制备规模的非水介质制备电泳进行了初步研究, 研究了有机介质浓度、pH 和离子强度对蛋白质电迁移率的影响, 并揭示出其可能的应用前景。
以强化传质为目标的耦合分离技术
1 制备型电动色谱技术
电场与色谱技术的结合是近年来在分析和制备色谱技术研究中的一个重要方向。以电渗流为驱动力的色谱过程在毛细管电色谱中已被证明有很高的柱效率, 且分离速度快。本实验室系统地研究了电动色谱技术。亲和色谱过程施加电场后吸附过程的传质速率加快, 动态吸附容量提高。王东海等研究了电场下的离子交换色谱技术, 考察了交变电场下离子交换色谱过程的吸附和解析动力学及传质特性, 研究介质电渗的变化规律,证明是电渗强化孔内传质过程, 进而提高动态吸附容易, 并改善洗脱峰特性。殷钢等将电泳技术与羟基磷灰石色谱技术耦合, 发现电渗对分离特性有显著影响, 吸附速度加快, 动态吸附量增加, 进一步考察了电场对洗脱效果的影响。
利用电渗作为推动力, 避开制备电泳放大中面临的焦耳热问题, 是发展电动耦合分离技术的重要方向。
2 膨胀床色谱技术
传统色谱的最大不足是不能处理含固体颗粒的料液, 90 年代产生的膨胀床色谱技术将固2液流态化技术与色谱过程耦合, 在吸附和淋洗过程中, 具有精密控制的密度分布的介质颗粒均匀悬浮在膨胀床中, 使吸附和淋洗过程大大加快, 细胞碎片等不溶物从顶部排出, 实现了离心、过滤和纯化的一体化操作Maurizi 等人曾针对从枯草芽孢杆菌发酵液中提取重组人白介素1受体拮抗体( IL2lra) 的问题进行了方法对比研究。第一种方法包括离心、过滤、阳离子交换色谱(S Sepharose) 和阴离子交换色谱(Mono Q) 4 个步骤, 第二种方法只包括STREAMLINE SP 膨胀床色谱和阴离子交换色谱(Mono Q) 2 个步骤。前一种方法得到的产物纯度为98 % , 回收率为74 %; 而后一种方法得到的产物纯度为90 %~92 % , 回收率为85 %。这证明了该技术的实效性和先进性。应用膨胀床色谱要求料液中固体颗粒的物性与吸附剂有较大差别; 如果料液粘度和电导率很高, 则需先稀释, 这增加了处理量; 料液组分的复杂性也使得吸附容易降低。开发吸附容量大, 选择性高, 适用范围广, 价格低廉的吸附剂是膨胀床色谱技术研究的重点。
生物分离过程的高效集成化
从发展趋势来看, 生化分离技术研究的目的是要缩短整个下游过程的流程和提高单项操作的效率, 以前的那种零敲碎打的做法, 既费时、费力, 效果又不明显, 跟不上发展的步伐。现在对整个生物分离过程的研究要有一个质的转变, 国内外许多专家和研究者认同了这种转变, 并认为可以从两个方面着手, 其一, 继续研究和完善一些适用于生化工程的新型分离技术; 其二, 进行各种分离技术的高效集成化。目前出现的一些新型单元分离技术, 如亲和法、双水相分配技术、逆胶束法、液膜法、各类高效层析法等, 就是方向一的研究结果, 而作为方向二的高效集成化,目前研究比较热门的是将双水相分配技术与亲和法结合而形成的效率更高、选择性更强的双水相亲和分配组合技术; 将亲和色谱及膜分离结合的亲和膜分离技术; 可以将离心的处理量、超滤的浓缩效能及层析的纯化能力合而为一的扩张床吸附技术等。
过程集成( Process Integration) 是一般化学加工过程的重要研究方向, 生物分离过程的高效集成化目前国际上尚无明确的定义, 但根据国内外期刊上的报导, 是否可以认为, 生物分离过程的高效集成化技术的含义在于利用已有的和新近开发的生化分离技术, 将下游过程中的有关单元进行有效组合(集成) , 或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术, 达到提高产品收率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。按上述定义, 生物分离过程的高效集成化技术包括生化分离技术的集成化和生物分离过程的集成化两方面的内容, 这种只需一种技术就达到完成后处理过程中几步或全部操作的方法, 高度体现了过程集成化的优势。