新鲜配制10mg/ml的a -氰基-4-羟基肉桂酸于丙酮/2-丙醇(1:1v/v)中,以 4:1的比例和硝酸纤维素[10mg/ml在丙酮/2-丙醇(1:1v/v)]混合。点约0.3m l 基质混合液于靶上,需将基质经蒸发保持成薄层(膜)。很小心地加0.3m l 5%甲酸于靶上,然后再直接加0.5m l样品。让靶自然干燥。用5%甲酸洗靶(~1m l/靶)。用高压气体吹干过量的洗液,最后将靶装入质谱仪。
纳米电喷雾和在线LC-MS/MS两种方法是相互补充的,各有优势。例如,纳米电喷雾更适于全新序列的分析(de novo sequencing),可以对非常复杂的混合物进行蛋白序列分析,而在线LC-MS/MS几乎可以达到无人操作的自动化程度(unattended operation)。许多测序实验室同时使用这两种方法。在下面我们将介绍因样品不同而采用不同技术的策略.
任何数据库,包括基因组数据库,原则上能用肽质量数和序列标签数据查寻(21)。为加快速度,有的程序对数据库先作予索引,而其它程序(通常使用多个程序或贝奥伍尔夫簇(Beowulf clusters))可以直接处理原始序列数据而不影响操作。应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库。NRDB由SWISSPROT和GENPETP等几个数据库组成。dbEST是由国家生物技术信息中心/欧洲生物信息学研究所(National Centre for Biotechnology Information/European Bioinformatics Institute NCBI/EBI)共同编辑的核酸数据库,包括许多生物体的表达序列标签。dbEST库目前(2000年2月4日)包括3,569,075个条目,估计代表~80%人的基因。用肽序列标签或部分序列信息最适合查寻dbEST库,而大多数情况下用肽质量数是无效的。虽然也有用单个表达序列标签完全代表小蛋白的例子,但表达序列标签(ESTs)仅含有几百个碱基对,只能覆盖很少的胰蛋白酶酶解肽段。在dbEST库中,~2-5%的序列错误率也会阻碍鉴定。最近已有报道强调用质谱数据查寻dbEST库以便鉴定生物学家最感兴趣的以前未表征的蛋白质的重要性(20)。例如,Neubauer 等(25)讲述了对哺乳动物剪接体(Spliceosome)组分的全面鉴定。他们用双向电泳分离和纳升电喷雾质谱测定鉴定后,使用公共EST数据库克隆了新的组分。该方法的成功有力地说明人类EST数据库已能满足用质谱数据快速表征哺乳动物多蛋白质复合物的要求。
补充证据。Rigaut et al.(Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., and Séraphin, B., (1999) Nature Biotechnol. 17, 1030-1032) 最近报道了他们的串联亲和纯化(TAP)策略,用来纯化酵母蛋白质复合物的双标记方法。类似的方法可推动鉴定哺乳动物蛋白复合物。