前段时间开了一个讨论帖，推断缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、苏氨酸（T）、赖氨酸（K）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）的出峰顺序。原帖链接如下：

节后第一讨论贴--已知解离常数预测出峰顺序！http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20130219/4574102/

帖子的点击率说明还是有不少网友关注的，在此先谢过大家的捧场。该贴到目前为止共有两位网友参与讨论，并都给出了各自不同的答案。我的答案跟他们的相差比较大，特此摆出来跟大家分享讨论。说的不一定对，只是抛砖引玉，希望大家畅所欲言。

以下讨论全部以CZE为前提，且GBE只有缓冲溶液，没有任何其他添加剂（如有机溶剂）。

要预测出峰顺序，首先得弄清楚这个物质的酸碱性。如果是弱酸性物质，在羧基完全解离的情况下，物质带负电荷，则荷质比越大出峰时间越晚。如果是弱碱性物质，完全电离时物质带正电荷，出峰顺序正好反过来，即荷质比越大，出峰时间越短。

另外酸性物质，pKa>pH时，羧基解离；碱性物质，pKa<pH时，碱基解离。

在此理论下，以上给出的所有氨基酸，带的电荷都是一样的：pH都大于pKa1，所以所有氨基酸的羧基均解离，带一个单位负电荷。而所给的pH也都小于pKa2（K除外），所以氨基也都解离并带上一个单位正电荷。对于K，pH小于pKa2，氨基没有解离，但是它有一个碱性的R基，并且pKR大于pH，所以也是带上了一个单位的正电荷。

再者，该缓冲体系为碱性（pH9.0），且远远大于pKa1，所以氨基的作用占主导地位，也就是说，在这个buffer条件下，氨基的影响起主要作用，这些氨基酸所带的有效电荷应为正电荷。符合上面说的碱性物质出峰顺序的原则：即荷质比越大，出峰时间越短。

荷质比从大到小为：V、T、L=I、K、F、W，所以理论上的出峰顺序也是V、T、L=I、K、F、W。

但是，但是！！！！！！

大家一定要知道，K（赖氨酸）的侧链是这些氨基酸当中唯一呈碱性的（其他6个氨基酸的侧链均为中性），所以K一定是且必须是最后出峰！另外，我自己的实验经验，I比L先出峰。

所以，最后的出峰顺序为：V、T、I、L、F、W、K

注：以上讨论完全为原创也没有引用任何paper或书籍等理论，冒险大胆推断。有砖的尽管拍，没砖的就赶紧留个脚印表扬一下吧！

-----------------------------------------------------

下面附上两位网友的答案，感谢他们的积极参与！

1 flysky97：

对于赖氨酸pI>9.0 ，其他均<9.0 赖氨酸第一个出来；
分子量由大到小（其倒数由小到大顺序）为：
色W: 204.23
苯F: 165.19
赖K: 146.19
亮L: 131.17＝异亮I: 131.17
苏T: 119.12
缬V: 117.15

我先猜一下顺序（不对莫怪）：
赖氨酸Lys
色氨酸try
苯丙Phe
异亮氨酸iso
亮氨酸leu
苏氨酸thr
缬氨酸val

flysky97的推测跟我的正好完全相反，可能是没注意到物质的酸碱性问题，呵呵~

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2 wy20071722

这个东西我想可能跟质量的关系不大，应该主要跟阻力有关，因为如果力平衡的话，就跟质量没关系了。等电点不同，解离度不同。主要跟电荷和半径有关系。考虑解离度不同，顺序：
赖
苏
异亮
亮
缬
色
苯丙
这个没有考虑和溶液缓冲离子的相互作用影响，像后面几个pH接近，特别像亮和异亮，可能分不开，不清楚他们之间分子大小和电动势的差异，有可能会出峰与预测相悖，但这样的话不相符的部分迁移时间应该是接近的。
分离不同等电点的应该是用等电聚焦来做吧。

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2013/4/26 0:30:49 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

呵呵，我能猜得完全相反也不容易呀……

该帖子作者被版主 nini2006加 5积分， 2经验，加分理由：还是很不错的，谢谢参与

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wy20071722

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2013/4/26 10:00:45 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我还是想争辩一下。我从等电点来考虑：在等电聚焦试验下，氨基酸应该停留在等电点的位置，也就是说在pI值时在电场的作用下是不移动的，这个时候认为氨基酸是中性的（把氨基酸作为一个整体考虑，不论个别基团）。那么当pH大于pI时，这是碱式解离受到抑制，酸式解离收到促进，解离产物带负电，pH-pI值越大，解离越完全，这个要具体查解离曲线了。这里我们假定当pH-pI大于3时就完全解离了，这个时候应该带上完全的负电，出峰最慢。在pH相同的条件下，pI值应该越小，pH-pI值越大，解离越完全，出峰越慢。（电渗流都是一样的，最终的有效淌度与解离度和绝对淌度成正比，这在陈义的书中有介绍），那么直接考虑pI值应该是越大出峰越快了。至于绝对淌度，在速度平衡的情况下，qE=6πηrV，并没有显示和质量有关，而是和场强、电荷、溶液黏度、离子半径有关，这从平衡状态下没有加速度就和质量关系不大来考虑也是合理的。至于质量，我认为需要从吸附、离子云效应考虑的时候才有关，这个大多数情况下大家都不考虑了。也因为这样，pI值在6左右的氨基酸应该主要跟离子半径有关，因为溶液黏度和场强都是相同的，而这部分氨基酸只带一个氨基和羧基，都解离完全，所带电荷都接近，所以出峰容易与预测产生偏差，分不开的可能性更大些。

这里是把氨基酸作为一个整体来考虑，分开来考虑的话pI值接近的顺序可能会有差别，但其他的应该差别不大。

不过话又说回来，有时候好像真的和质量是有关系的，真是叫人糊涂啊

个人见解，欢迎拍砖。

该帖子作者被版主 nini2006加 8积分， 2经验，加分理由：说得很有道理！

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2013/4/26 10:42:27 Last edit by wy20071722

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2013/4/26 13:19:53 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 wy20071722(wy20071722) 发表:
我还是想争辩一下。我从等电点来考虑：在等电聚焦试验下，氨基酸应该停留在等电点的位置，也就是说在pI值时在电场的作用下是不移动的，这个时候认为氨基酸是中性的（把氨基酸作为一个整体考虑，不论个别基团）。那么当pH大于pI时，这是碱式解离受到抑制，酸式解离收到促进，解离产物带负电，pH-pI值越大，解离越完全，这个要具体查解离曲线了。这里我们假定当pH-pI大于3时就完全解离了，这个时候应该带上完全的负电，出峰最慢。在pH相同的条件下，pI值应该越小，pH-pI值越大，解离越完全，出峰越慢。（电渗流都是一样的，最终的有效淌度与解离度和绝对淌度成正比，这在陈义的书中有介绍），那么直接考虑pI值应该是越大出峰越快了。至于绝对淌度，在速度平衡的情况下，qE=6πηrV，并没有显示和质量有关，而是和场强、电荷、溶液黏度、离子半径有关，这从平衡状态下没有加速度就和质量关系不大来考虑也是合理的。至于质量，我认为需要从吸附、离子云效应考虑的时候才有关，这个大多数情况下大家都不考虑了。也因为这样，pI值在6左右的氨基酸应该主要跟离子半径有关，因为溶液黏度和场强都是相同的，而这部分氨基酸只带一个氨基和羧基，都解离完全，所带电荷都接近，所以出峰容易与预测产生偏差，分不开的可能性更大些。

这里是把氨基酸作为一个整体来考虑，分开来考虑的话pI值接近的顺序可能会有差别，但其他的应该差别不大。

不过话又说回来，有时候好像真的和质量是有关系的，真是叫人糊涂啊

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wy2007很enlighten啊，说的很有道理，我只关注了荷质比而忽略了等电点。原帖里面自己给网友的提示其实也有提示到等电点的，可是自己在整理这个答案的时候偏偏自己给忘了。

不过，物质的出峰顺序机理真的是很复杂，除了你所关注的等电点问题，荷质比是一定不能忽略的。其实捷克Charles University的一个组早在05年就已经推出了一款叫做peakmaster的软件，只要输入buffer的相关参数，用这个软件就能够模拟出对应的谱图来。其中离子半径也是其中的一个重要参数。

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2013/4/26 13:27:20 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

影响出峰顺序的因素很多，wy2007所说的都在理。关键看什么因素在起主要作用。
如果谁有兴趣的话可以做一下实验验证就可以知道，我们所提出的那么多依据当中，到底哪个因素在起主导作用。
我所提出的这个假想的条件如果是UV detector的话根本做不了的，因为这些氨基酸没有紫外响应，要衍生。衍生后成了别的物质，上面所给的参数全部不能用了。用电导致化学发光或质谱等检测器的话，倒是有可能做到。

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2013/4/26 13:28:30 Last edit by nini2006