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毛细管电泳（CE）
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主题：【求助】毛细管电泳-间接激光诱导荧光

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lkqzpp
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发表于：2013/12/17 16:58:11 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
请教大家，原理上是不是如果被测物没有荧光，只要抬高荧光背景，电泳时就会出负峰呢？我测的4个不同的物质，都没有荧光，在同一个体系跑CZE-间接激光诱导荧光,发现出的色谱图相同，不知怎么破解？

求大神科普一下间接激光诱导荧光的知识和经验
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2013/12/17 19:10:34 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你说的原理是对的。但是不理解你说的“在同一个体系跑CZE-间接激光诱导荧光,发现出的色谱图相同”。是出峰时间都一样吗？
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CEcret
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2013/12/18 7:33:06 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
跟间接紫外法类似，如果数据不加处理你应该都看到倒峰，只是迁移时间不一样。
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ericwong
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2013/12/18 8:33:32 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主检测的是什么样品？
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lkqzpp
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2013/12/18 10:11:37 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 nini2006(nini2006) 发表:
你说的原理是对的。但是不理解你说的“在同一个体系跑CZE-间接激光诱导荧光,发现出的色谱图相同”。是出峰时间都一样吗？


1 直接法，仪器贝克曼PA800，背景缓冲溶液20mM硼酸钠，pH8.5,电压20Kv,未涂敷毛细管内径75微米有效长度38.2厘米，荧光检测器488纳米激发520纳米，四个样品瓶里分别是空白，10mM黄曲霉毒素，10mM赭曲霉毒素，10mM伏马毒素，四个物质在该条件下跑电泳都没有峰，是不是可以认为这四个物质在该条件下都没有荧光？然后就考虑用间接法




2 间接法，其他条件同上背景缓冲溶液中加了3×10-7M的荧光素钠，四个样品出的峰都是一样的,2.6分钟左右有一正峰，3.0分钟左右有一小负峰。
附件：
2013.pdf
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2013/12/18 11:36:34 Last edit by wy20071722
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2013/12/18 10:17:01 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 ericwong(ericwong) 发表:
楼主检测的是什么样品？


四个样品瓶里分别是空白，10mM黄曲霉毒素，10mM赭曲霉毒素，10mM伏马毒素，三个样品都是用乙腈水体积比10比90溶解的。这几个毒素本身在300多纳米激发400多纳米时是有荧光的。我们的检测器时488激发520，跑的时候没有峰。见附件
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wy20071722
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2013/12/18 11:47:10 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lkqzpp(lkqzpp) 发表:
原文由 nini2006(nini2006) 发表:
你说的原理是对的。但是不理解你说的“在同一个体系跑CZE-间接激光诱导荧光,发现出的色谱图相同”。是出峰时间都一样吗？


1 直接法，仪器贝克曼PA800，背景缓冲溶液20mM硼酸钠，pH8.5,电压20Kv,未涂敷毛细管内径75微米有效长度38.2厘米，荧光检测器488纳米激发520纳米，四个样品瓶里分别是空白，10mM黄曲霉毒素，10mM赭曲霉毒素，10mM伏马毒素，四个物质在该条件下跑电泳都没有峰，是不是可以认为这四个物质在该条件下都没有荧光？然后就考虑用间接法




2 间接法，其他条件同上背景缓冲溶液中加了3×10-7M的荧光素钠，四个样品出的峰都是一样的,2.6分钟左右有一正峰，3.0分钟左右有一小负峰。






图贴上来了就好多了。建议你先用气压推一下，看看有没有荧光。还有如果是自身带荧光的话不知道荧光强度怎么样，纵坐标不要拉的太大。另外也有可能只是在488波长不受激发没有荧光。然后在考虑用间接法。间接法在Beckman的方法设置里有个勾选，勾上以后负峰会变成正峰的。
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CEcret
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2013/12/18 15:33:51 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
首先呢，这几种毒素都是有自身荧光的。但是具体的检测波长需要搜索一下文献的，几种物质不一样的。

第二呢，这几种物质自身好像都不带电，应该要用MEKC或者其他手段才可以分开。
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2013/12/18 23:56:15 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一张图完全不是没有峰的样子，而是好像检测器灯根本没打开的感觉。不然，好歹会有点基线起伏。

第二张图里面的那个大峰，不想是样品峰，而像是溶剂峰，那个倒峰也是很常见的鬼峰而已。你试试用你样品的溶剂进样测试一下，看看有没有峰就知道这个是否是你的样品峰了。

如果那个大峰就是你的样品峰，那说明你这四个物质没有分开，想想办法如何把它们分开吧
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2013/12/19 8:41:57 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 CEcret(v2812644) 发表:
首先呢，这几种毒素都是有自身荧光的。但是具体的检测波长需要搜索一下文献的，几种物质不一样的。

第二呢，这几种物质自身好像都不带电，应该要用MEKC或者其他手段才可以分开。

说得不错，毛细管电泳是依靠不同样品的质荷比不同进行分离。如果是物质都是中性的，那就不能简单用CZE模式了。
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2013/12/19 8:42:21 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
将样品做成混合样，各个成分的浓度与原先相同。然后再看看负峰的大小有没有变化。
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