主题：【原创】无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a

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单波长貌似线性更好

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无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a

--测量篇

自然水体中往往滋生各种藻类，不同藻类具有不同的色素组成，但都含有叶绿素a，不仅含量高，而且是整个光合作用的能量传递中心，因此把叶绿素a作为浮游植物现存量的指标。

采用分光光度法测量叶绿素a，萃取剂主要有丙酮、乙醇和DMF,出于安全、保健的考虑，建议使用乙醇。

乙醇法多采用单波长法^[1]，计算公式为：

  Chla=27.9×[(B₆₆₅-B₇₅₀)-(A₆₆₅-A₇₅₀)]·V_乙醇/V_水样

式中，Cla：叶绿素a浓度，mg/m³;B₆₆₅:波长665nm处的吸光值；B₇₅₀：750nm处的吸光值；A₆₆₅： 665nm处吸光值；A₇₅₀： 750nm处吸光值；V_乙醇：乙醇萃取液定容后体积，ml；V_水样：取样体积，L；使用1cm比色皿。

叶绿素a是卟啉化合物，卟啉环的中心有一个镁（Mg）原子，  当卟啉环缺少中心部分的镁原子时便成为脱镁叶绿素。在光合器官中除含有叶绿素a和b外，还含有少量脱镁叶绿素。脱镁叶绿素是否具有光合作用，暂不讨论。叶绿素经酸处理， Mg被H取代降解为去镁叶绿素a，上述公式的计算结果应是扣除去镁叶绿素a的叶绿素a浓度。

采用单色法测定时，加酸量、酸化稳定的时间非常关键。根据韩桂春研究结果^[2]，酸化时间为15分钟，但盐酸浓度和用量目前还没有统一的意见^[3，4]。酸化在比色皿中进行，不利于样品匀化和多样品测量。

丙酮法采用多波长法^[5]，从各波长的吸光度中减去波长750nm的吸光度，作为校正过的吸光度，计算公式：

Chla=(11.64D₆₆₃-2.16D₆₄₅+0.10A₆₆₅)]×V_乙醇/V_水样·δ

δ-比色皿光程cm

图1叶绿素a和叶绿素b的吸收光谱(来自网络)

从图1看出，在波长663附近，叶绿素b有少量的吸收，三波长法主要考虑叶绿素b对测定的影响。无需酸化，相对于单波长测量过程简便多了。

两种方法考虑影响因子不同，结果的客观性就会有差异。差异有多大，如果采用乙醇萃取，多波长比色是否可行？

实验过程

• 
  
  水样处理
  
  本实验室制备的含藻水样，浓度较高，取20ml，加入5滴1%碳酸镁溶液，经玻璃纤维滤纸过滤,将带样品的滤纸对折放入冰箱冷冻室保存过夜。
  
  

2.叶绿素的提取



根据无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a^[6]，取出滤纸剪碎后放入10ml离心管中，加入约5ml无水乙醇，60℃水浴超声萃取25分钟，无水乙醇少量多次洗涤滤纸，收集滤液，定容至10ml。



叶绿素是否完全提取是实验的关键，过滤后的滤纸洁白如初说明无水乙醇、热浴、超声、过滤结合的溶解、分离方法是高效的。



3.叶绿素的测定



TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司生产。12年12月31日开始使用，稳定可靠，简单易用。本次实验应用多波长分光光度法解决浊度背景干扰和共存物质的光谱干扰问题，测量参数：波长630,645，663,665,750nm，固定样品池测定。




为避免提取过程的误差，将叶绿素酒精溶液混合均匀，分装于5个10ml比色管（带有5ml刻度）中，少量润洗比色池，取适量溶液测量吸光度值。







4.结果统计

取样体积	665	663	645	630	750	三波长计算结果
1	0.02	0.346	0.341	0.125	0.081	0.001	1848.93
2	0.02	0.348	0.342	0.126	0.082	0.001	1853.72
3	0.02	0.347	0.342	0.126	0.082	0.001	1853.72
4	0.02	0.367	0.362	0.146	0.102	0.021	1854.72
5	0.02	0.347	0.341	0.126	0.082	0.002	1843.16
酸化后（盐酸）	单波长计算结果
1+11	0.02	0.209	0.207	0.069	0.031	0.003	1939.05
1+9	0.02	0.209	0.208	0.07	0.032	0.004	1980.9
1+5	0.02	0.199	0.201	0.075	0.031	0.003	2092.5
1+3	0.02	0.192	0.197	0.08	0.032	0.003	2190.15
1+1	0.02	0.192	0.197	0.081	0.032	0.004	2190.15

表1单波长和三波长计算结果

图2叶绿素测量值与盐酸浓度关系

图2，盐酸浓度1-5分别为1+11,1+9,1+5，1+3,1+1，从图中可知，随盐酸浓度增高叶绿素测量值有所增加，盐酸浓度达到1+3后趋于稳定。

一组平行样，多波长测量后各加1滴1+1盐酸，测量酸化后的吸光度值，计算及统计结果如下。可以看出：单波长的结果大于三波长，但无显著性差异，因此两种方法可以相互替代。

                                                                                                                                                       

取样体积L		三波长计算结果		单波长计算结果
1	0.02		1420.1		1604.2
2	0.02		1403.7		1534.5
3	0.02		1388.1		1520.6
4	0.02		1426.8		1660
t-检验: 双样本异方差假设
变量 1		变量 2
平均		1409.675		1579.825
方差		301.0425		4194.709
观测值		4		4
假设平均差		0
df		3
t Stat		-5.07529
P(T<=t) 单尾		0.007387
t 单尾临界		2.353363
P(T<=t) 双尾		0.014774
t 双尾临界		3.182446

参考文献:

[1].章宗涉，黄祥飞.淡水浮游生物研究方法.北京：科学出版社，1991，345-348.

[2].韩桂春，谷风，张忠臣.淡水中叶绿素a测定方法的探讨[J].中国环境监测，2005，21（1）：55-57.

[3].陈宇炜，陈开宁，胡耀辉.浮游植物叶绿素a测定的“热乙醇法”及其测定误差的探讨[J].湖泊科学，2006，18（5）：550-552.

[4]杨洪芳，丁峰元，陈德辉.乙醇-超声法在浮游植物叶绿素a含量测定中的应用[J].海洋渔业，2006，28（4）：309-313。

[5]水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社,2002.

[6]王丽娟，章岳蓬，郭步平. 无水乙醇热浴超声法测定淡水中的叶绿素a.当代环保

[J]，2010,2(4):14-17.

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原文由 zyl3367898(zyl3367898) 发表:
滤液是绿色的对还是是白色的对？另外玻璃柱里装的是棉花吗？不如用10mL一次性针管装棉花，不用清洗，直接扔掉。

原文由 luckyxiaoyu(luckyxiaoyu) 发表:

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单波长貌似线性更好

这次实验结果是这样，有偶然误差的因素，样本太少，不足说明单波长的精密度更好，所以我的结论是两种方法可以互换