在RP液相色谱中，为了得到较好的峰形和分离度，会在流动相中加入适量的酸，碱和盐，由此也会引发各种各样的问题，再加上中药化药的分析方式的不同，现将个人实验经历及实际感触简要介绍如下

（1）压力

当在流动相中加入分析纯的缓冲盐（如磷酸二氢钾）或其他酸（甲酸、磷酸）碱（三乙胺）后需要用滤膜过滤是众所周知的事情，而在使用缓冲盐的时候会有析出，在管路中析出表现为压力升高，在单向阀处则会出现压力大幅度波动，出现这类情况的主要原因还是缓冲盐遇到难溶有机溶剂所致。在反向色谱中，甲醇和乙腈为最常用的有机相，相比之下缓冲液在乙腈中更容易析出（如图，将20 ml ACN加入到30 mL 30 mmol的磷酸二氢钾中，侧面与顶端）。

最近因为用40%的乙腈-60% KH2PO4废掉一个保护住，清洗两次仪器。

当方法中乙腈称为比用有机相时，为避免色谱柱中存在的大量有机相遇盐析出可先用适量比例的有机相-纯水饱和色谱柱，此外，若为梯度洗脱，则应该将有机相的初始比例尽量调低。

（2）色谱柱的维护

当流动相中含有缓冲液时，对于色谱柱的损害变强，为增加色谱柱的使用寿命，我们会选择使用保护住和预柱（附注：保护住和预柱的安装位置不同作用也不同，大家可以在液相版面去搜索，也可查阅附件），二者各有分工，保护住确实可以有效地解决绝大部分进入色谱柱前的杂质，甚至饱和流动相（本为保护住的功能），若是将保护柱作为预柱使用，则会加速保护住柱芯的更换频率。

左图为全新柱芯，中间为用了三个月的缓冲盐（主要为磷酸盐、三氟乙酸类偏酸性），右图为半个多月的三乙胺pH 11-ACN（45：55）。可以明显发现三乙胺-乙腈对C-18的保护住具有明显的的溶解作用，随后使得系统压力超过4000 psi而停止运行。

在缓冲液，尤其是碱性缓冲液使用频率较高的实验室中，预柱的使用则显得十分必要。

此外，若是将预柱作为保护住接在进样器后，色谱柱之前，很可能会影响色谱峰的峰形，甚至影响分离，而基线波动也会明显变大，在示差检测器（RI）中可以有3倍的差距，在化药做杂质方法时，噪音的大小可能成为分析结果的关键因素。

（3）基线的波动

在梯度洗脱过程中，加入缓冲盐的流动相可能会引起基线漂移，当检测波长较低时（〈220 nm），这种变化会更加明显。这种漂移的主要原因是流动相及缓冲盐的末端吸收，及分析过程中流动相的比例发生变化所致，因此要想解决这种漂移，可以从这两个方面入手。（1 选择末端吸收更低的流动相和缓冲盐，有机相乙腈比甲醇好；（2 减小有机相与水相中缓冲物质的差异，在部分化药分析中，会将水相和有机相中均加入相同量的缓冲物质，eg. A相 ACN-H2O-TFA(950:50:1); B相ACN-H2O-TFA(50:950:1)

附件：

反相流动相缓冲溶液选择和配制指南.pdf

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