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主题：【第八届原创】ＶＩＩＩ因子氨基酸含量测定之：组氨酸与甘氨酸快快分开！

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青林
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发表于：2015/09/26 09:58:02 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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维权声明：本文为wyqql2060原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
本人在8月发表的一篇原创中提及”甘氨酸与组氨酸无法分离“的问题，在经过10多天的准备，已有不小的收获，现在分享。
摘要  目的: 建立用高效液相色谱法测定人凝血因子VIII中氨基酸含量。方法: 采用6 － 氨基喹啉－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 为衍生剂，与氨基酸柱前衍生后，用Agilent 1200 高效液相色谱仪，AccQ·Tag C18柱( waters 150 mm ×3. 9 mm，4 μm) ，以水Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液和乙腈进行梯度洗脱，检测波长为248 nm，柱温37 ℃，进样量10μL。结果: 各氨基酸在32 min 内测定完毕，回收率为98.7% ～ 101.5%。RSD 均小于1. 5%。结论: 本法分离度好，快速、简便，可作为产品的质量控制方法。
关键词: 6 － 氨基喹啉－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯; 人凝血因子VIII; 甘氨酸; 衍生物; 梯度洗脱; 高效液相色谱法;氨基酸; 含量测定
人凝血因子VIII，本品对缺乏人凝血因子礓所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。
该药物制备过程中使用了氨基酸( 精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、盐酸赖氨酸、脯氨酸 等) 做稳定剂，为了保证药品质量和用药安全，应对其中氨基酸的含量进行控制。该法依据过量的6 － 氨基喹啉基－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 在一定条件和氨基酸形成稳定的衍生产物( 柱前衍生) ，用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算人凝血因子中各氨基酸的含量。

1 仪器和试药
1200 高效液相色谱系统( 美国Agilent 公司) ，配置低压四元梯度泵、1314B 紫外吸收检测器、自动进样器、柱温箱、Chemistations 化学工作站; Sartorius CP225D 电子微量天平( 德国Sartorius 公司) ; SartoriusPB － 21 型pH 计( 德国Sartorius 公司) ; LDZ5 －2 低速自动平衡离心机( 上海医用离心机厂) 等。

各标准品均来自于中国食品药品检定研究院


2 色谱条件及系统适用性试验
色谱柱: Waters AccQ·Tag C18色谱柱( 3. 9 mm ×150 mm) ; 流动相: 水为溶剂D，Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液( A) － 乙腈( B) － 水( D) ，柱温:37 ℃; 检测波长: 248 nm。精密量取对照品溶液与供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图32 min。
3 溶液制备
3. 1 Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液称取三水乙酸钠190. 4 g，加注射用水1000 mL，搅拌，溶解，用稀磷酸将pH 调至5. 2，加入乙二胺四乙酸二钠溶液( 称取乙二胺四乙酸二钠100 mg，加注射用水100 mL，摇匀使其溶解) 10 mL，加入叠氮化钠0. 1 g 及三乙胺23. 7 mL( 17. 2 g) ，用稀磷酸滴定至pH 4. 95，用0. 45 μm 的滤膜过滤，于4 ℃储存，备用( 此条件下可保存6 个月) 。量取该溶液100 mL，加注射用水稀释至1000 mL，混匀，即得Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液。
3. 2 对照品储备液混合对照品储备液精密称取各氨基酸对照品适量，置同一100 mL量瓶中，以注射用水溶解并定容至刻度。制成含氨基酸含量均含5. 0 mg·mL － 1 的混合对照品溶液，即得。
单个对照品储备液: 精密称取各含氨基酸的各对照品适量，分别置100mL 量瓶中，用注射用水溶解并定容至刻度。制成分别含各氨基酸的单个对照品溶液，即得。
3. 3 供试品储备液
3. 3. 1 加样回收率试验溶液精密称取各氨基酸各0. 3200，0. 4000，0. 4800 g 和辅料适量，加人凝血因子VIII原液7. 5 mL，肝素钠适量，用1. 0 mol·L － 1 盐酸调pH 至6. 9，加0. 01 mol·L － 1枸橼酸三钠溶液溶解并定容于20 mL。分别制备成16. 0， 20. 0， 24. 0 mg·mL － 1溶液。
3. 3. 2 空白溶液  按公司处方，加入辅料的混合物，用注射用水制备各空白溶液
3. 4 内标溶液精密称取α － 氨基丁酸( AABA)0. 4 g，加注射用水定容至100 mL。
4 氨基酸衍生方法
4. 1 精密量取供试品储备液、样品及对照品储备液各1. 0 mL，加1. 5%磺基水杨酸9. 0 mL，混匀静置2 h以上， 3000 r·min － 1离心10 min，留取上清液。
4. 2 精密量取“4. 1”项下上清液1. 0 mL( 其中对照品储备液对应上清液分别精密量取0. 06， 0. 4，0. 8，1. 0， 1. 2， 1. 6 mL) ，分别置10 mL 量瓶中，用注射用水定容。制备成供试品溶液、样品溶液及浓度分别为1. 5， 10. 0， 20. 0， 25. 0， 30. 0，40. 0 mg·mL － 1 的对照品溶液。
4. 3 精密量取“4. 2”项下溶液各100 μL，分别加注射用水0. 4 mL 及内标溶液20 μL，混匀备用。
4. 4 精密量取“4. 3”项下溶液30 μL 放入衍生管中，加硼酸缓冲液( pH 8 ～ 10) 210 μL 涡旋混合，并加入AQC 衍生剂60 μL 涡旋混合15 s，即为各供试品溶液，待用。
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2015/9/26 10:01:02 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
针对上次的结果，为了使组氨酸与甘氨酸有效分开，本人对梯度洗脱的程序进行修改
1、为了使10min--19min之间有足够多的峰，应将之间的时间变长。

2、利用洗脱的线速度来说，3.9*150mm的色谱柱及10ul的体积，走完色谱柱需要5,min。故减少6%乙腈时间应该在5-6min左右。从7min开始试验，看组氨酸与甘氨酸是否有分离的迹象。
序列表1


图谱1,甘氨酸与组氨酸有部分分离。

结果证明，组氨酸与甘氨酸果然有分离
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2015/9/26 10:23:00 Last edit by wyqql2060
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2015/9/26 10:02:57 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
继续减少6%的乙晴的梯度洗脱时间
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2015/9/26 10:04:16 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
继续减少

甘氨酸与组氨酸分的越来越开了
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2015/9/26 10:07:04 Last edit by wyqql2060
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2015/9/26 10:06:20 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
过了，不行了


达到４ｍｉｎ时，组氨酸的峰洗脱加快，且峰的数目也不对，估计被包在６ｍｉｎ的大峰里面
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2015/9/26 10:29:02 Last edit by wyqql2060
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2015/9/26 10:07:43 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
继续优化
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2015/9/26 10:08:37 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
好了，这是最好的结果了，
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2015/9/26 10:13:04 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
最终图谱，组氨酸与甘氨酸分离度大于1.5，1.669，差强人意。
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2015/9/26 11:11:39 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
５。结果与讨论
５１　按新的试验方法，进行准确度和重复性试验，准确度在95.0%-105.0%之间，9次数据的RSD小于2.0%
5.2      通过线速度理论可以减少试验的摸索时间，梯度的适当调整可以有效改善试验结果
5.3    由于最佳试验的分离度未1.669，虽然符合”大于1.5“的要求，但不保险，还应从色谱柱、流动相（自配和买的可能有所区别）等因素再考虑。但由于时间太少，要搁置很久了。
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2015/9/26 11:14:40 Last edit by wyqql2060
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2015/9/26 12:29:28 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
希望大家给我建议，谢谢大家的支持
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荆棘鸟fiona
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2015/9/27 10:27:27 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 青林(wyqql2060) 发表:
希望大家给我建议，谢谢大家的支持
建议最好汇总到一楼哦~~，不然会扣分哒http://bbs.instrument.com.cn/topic/5958088
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