猪圆环病毒荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

1 前言

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一。病毒粒子直径14~17nm，呈20面体对称结构，无囊膜，含有共价闭合的单股环状负链DNA，基因组大小约为1.76kb。

PCV对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）、皮炎与肾病综合征(Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome,PDNS)的主要病原。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。

在病猪鼻黏膜、支气管、肺脏、扁桃体、肾脏、脾脏和小肠中有PCV2粒子存在。胸腺、脾、肠系膜、支气管等处的淋巴组织中均有该病毒，其中肺脏及淋巴结中检出率较高。表明PCV2严重侵害猪的免疫系统：病毒与巨噬细胞/单核细胞、组织细胞和胸腺巨噬细胞相伴随，导致患猪体况下降，形成免疫抑制。因此，有必要对猪圆环病毒进行检测，对感染PCV2的商品猪进行疫苗免疫，对PCV2长期阳性的种猪予以淘汰。

2 模块化检测方法思路

总体思路是：将动物疫病荧光定量PCR检测分为三个模块，核酸提取采用DNA/RNA共提试剂，核酸扩增采用预混液+引物探针方式，质控品利用抗原或商品化疫苗自制。具体思路如下：

——核酸提取采用DNA/RNA共提试剂；

——引物探针严格按照标准方法，委托生物工程公司合成；

——反应体系中其他成分，采购商品化qPCR预混液；

——质控品：阳性对照采用商品化疫苗，测定结果后按一定比例稀释，保存备用。

——反应体系：设为20μL，其中包含：预混液（2×）10μL、ROX 0.4μL为固定量，引物探针加入量根据检测标准中的终浓度予以换算，加灭菌水补足18μL，RNA模板为2μL；

——反应条件首先按照标准中的条件开展摸索，如达到预期效果则予以固定；如效果不佳则参照预混液及引物探针推荐条件进行适当调整。

3 材料和方法

3.1 病毒

猪圆环病毒疫苗。

3.2 试剂

DNA/RNA共提试剂盒：FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，南京诺维赞生产；

qPCR预混液：AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2，南京诺维赞生产。

3.3 引物探针

按照GB/T 35901-2018 《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》提供的序列，委托上海生工合成，引物稀释成10μmol/L、探针稀释成5μmol/L，分装成小包装冷冻保存备用。具体序列如下：

正向引物：5’-GGAGTCTGGTGACCGTTGC-3’

反向引物：5’-CCAATCACGCTTCTGCATTTT-3’

探针：5’-FAM-CCGCTCACTTTCAAAAGTTCAGCCA-BHQ1 -3’

3.4 反应体系

根据GB/T 35901-2018 《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》所载反应体系，按照终浓度一致原则予以转化。具体转换方法：

——反应体系总体积设定为20μL；

——将标准中反应体系的10×PCR Buffer、MgCl2、dNTPs、Taq酶等成分转换为qPCR预混液10μL（推荐量）；

——因使用ABI7500荧光PCR仪，故在体系中加入ROX 0.4μL；

——标准中正向引物、反向引物、探针的终浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L和0.12μmol/L，故在修改后的体系中加入量为0.4μL、0.4μL和0.48μL；

——总DNA加入量修改为2μL（根据经验该加入量已经足够）；

——根据上述各成分用量，补充体积的无核酸酶水修改为6.32μL。

标准方法		修改方法
10Χ PCR Buffer	5.0	2Χ qPCR预混液	10
Taq酶(5U/μL)	2.0	ROX	0.4
dNTPs(100mmol/L)	1.5	正向引物(10μmol/L)	0.4
MgCl2	0.25	反向引物(10μmol/L)	0.4
正向引物(10μmol/L)	1.0	探针(5μmol/L)	0.48
反向引物(10μmol/L)	1.0	无核酸酶水	6.32
探针(10μmol/L)	0.6	总DNA	2.0
无核酸酶水	26.95	总体积	20
内参质粒	0.2
总DNA	10
总体积	50

3.5 反应条件

参照GB/T 35901-2018 《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》推荐的扩增程序，结合ABI7500荧光采集时间不能少于34s的要求，进行预试验。扩增程序如下：

50℃2min →95℃2min →（95℃15s → 60℃34s）*40

如扩增结果理想，则不做修改直接采纳，否则进行适当调整。

4 试验结果

对猪圆环病毒疫苗（SH株）进行核酸检测，结果较理想。扩增曲线如下：

5 阳性质控的制备

根据GB/T 35901-2018 《猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法》规定，阳性对照应Ct≤30。对猪圆环病毒疫苗（SH株）适当稀释后进行再次检测，结果如下：

稀释倍数	1:10^0	1:10^1	1:10^2	1:10^3
PCV-2疫苗	20.99	25.17	30.68	34.80

经综合判定，最后采用猪圆环病毒疫苗（SH株）作1: 10^1稀释，分装为200μL/管作为阳性质控，Ct值约25，-70℃冻存备用。

6 讨论

6.1 检测工作更加方便高效

一是在核酸提取环节采用了DNA/RNA共提试剂，待检样品经一次提取核酸，除可应用于圆环病毒、非洲猪瘟等DNA病毒项目检测外，还可应用于口蹄疫、蓝耳病等RNA病毒项目检测；

二是由于实验室储备了足够量的qPCR预混液，在开展检测时，不必担心部分检测量较少的项目由于试剂组分不足而罢工事件的发生；

三是由于qPCR预混液适用于多数DNA病毒项目的检测，在检测任务发生重大变化时，可以方便地调整检测项目，不必担心试剂不足或浪费情况的发生。

6.2 阳性质控品制备方便

猪圆环病毒疫苗是较常用的动物免疫用疫苗，只需对疫苗进行含量测定，进行一定比例的稀释即可作为实验室内部的阳性质控品。

6.3 适用性有待进一步验证

尽管在构建新方法时，对适用性进行了验证，但对于其他毒株，尤其是较新型的变异株是否有效，尚有待进一步观察和验证。

6.4 严格依法依规操作

如果有关法律法规或上级有关部门出台政策，要求采用获批准的成品试剂盒用于检测，则实验室必须及时停止自建方法的使用。