主题：【分享】【实战宝典】免疫亲和柱-高效液相色谱法测定真菌毒素有哪些注意事项？

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发表于：2021/03/24 10:38:08 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

问题描述：在用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素和呕吐毒素等真菌毒素时，有哪些技术要点？特别是前处理过程、净化过程等方面。

解答：（1）测定食品中黄曲霉毒素的技术要点：

a.前处理过程：样品提取溶剂一般用甲醇或乙腈的水溶液。GB5009.22-2016《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》提取液用的是乙腈：水（V/V）=84：16，提取时要让提取液和样品充分混合，通常超声20min。净化首选相应的免疫亲和柱，操作步骤按照柱子使用说明即可。需要注意的是有机相洗脱时需要注意控制流速（控制2~3秒/滴），氮吹时气流要缓慢，不要把液体全部吹干，近干就可以，否则会严重影响回收率，最后用初始流动相定容。

b.上机检测过程：黄曲霉毒素B₂、G₂本身就可以产生很强的荧光，不需要衍生。而B₁、G₁分子的二呋喃结构中碳碳双键的吸电子诱导效应，致使其分子荧光强度减弱，不衍生的话达不到标准限量要求。通过对双键衍生变成饱和碳碳单键可增强B₁、G₁的荧光强度，通常采用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生、柱后碘衍生和光化学衍生等，GB 5009.22-2016对前两种衍生步骤做了详细说明。柱前三氟乙酸衍生优点是不需要增加额外衍生设备，但操作较为繁琐，影响因素较多，增加了前处理时间以及结果不确定度。柱后碘衍生的稳定性、重现性更好，但需要增加柱后衍生设备（泵和衍生管），同时由于衍生需要在衍生管中进行，增加了柱后死体积，易造成色谱峰变宽，且碘本身容易被氧化，每次试验都要重新配置。光化学衍生是将反应线圈绕在紫外灯外，当流动相进入反应圈时，B₁、G₁被衍生成荧光较强的物质，类似与三氟乙酸的反应，但同样需要单独购买光化学衍生设备。

（2）测定食品中呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇 DON）的技术要点：

a.前处理过程：呕吐毒素极性较强，易溶于水等极性溶剂，因此GB5009.111-2016 《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》使用的提取试剂是水，不用甲醇或乙腈的原因是该标准DON是使用紫外检测器在218nm处测定，加入有机试剂的话会将样品中如色素等大量杂质提取出，干扰目标物检测。前处理过程也是用免疫亲和柱法，注意事项与黄曲霉毒素类似。

b.上机检测过程：由于DON紫外最大吸收波长在220nm附近（GB 5009.111-2016标准使用218nm），流动相甲醇和水比例对DON与样品杂质的分离度影响很大，218nm波长处色谱图上会有一个很大的杂质峰（可能是与DON结构性质相近的能被免疫亲和柱保留洗脱的物质）。标准上给出的甲醇：水（V/V）=20/80比例是针对标准推荐的色谱柱，实验时要根据自己使用的色谱柱对流动相比例进行调节，否则很可能造成杂质峰与DON分离度不好，影响定性定量。有研究表明，选择DON次吸收波长（240nm），虽然DON响应值有所下降（能满足标准检出限要求），但该干扰杂质下降更多，也可以考虑作为备选波长。紫外相对荧光更容易受到杂质干扰，可能出现“假阳性”判定，有条件的话选用二极管阵列检测器（DAD）可以进行全波长扫描，得到三维谱图，有助于排除“假阳性”样品。

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