主题：【已应助】【实验方法】决定凝胶迁移实验成功的3要素是什么？

四大关键因素

一、实验设计

用药品刺激细胞时，设计的药品浓度和时间梯度的问题，这个很关键!

【建议总结】:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度!二是用药物刺激产生受体可能时间会长一些，因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程。时间可以长一些，主要根据自己的药物刺激特性确定时间点。

二、核蛋白样品的制备

1.注意用专用的核蛋白抽提试剂来做，才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像;

2.掌握好核蛋白的浓度和纯度，尤其是浓度。能入核的蛋白本来就不是很多，所以核蛋白的浓度往往不会很高，但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是比较高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以，但是不能太低，否则影响结合反应拿不到结果。这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失。

3.同时，一般制备核蛋白的材料为细胞和组织，细胞要比组织好做的多，最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多。而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会不容易得到EMSA阳性结果!

三、探针的制备

生物素标记到3’端还是5’端?其实我觉得最好还是两端都标记，这样才能更好的提高灵敏度，国内的标记技术我还不是很了解，我们这边的探真都是国外定做的，还算可以，其制作程序如下:合成寡核苷酸---标记生物素---纯化---退火合成双链.也是一个比较复杂的过程。(在EMSA操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验员的保护)

四、EMSA实验技术要点

1.制胶

必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果。

『10X TBE 1.0ml

40% Acrylamide(40%聚丙烯酰胺) 3.3ml50% Glycerol(50%甘油) 1.0mldH2O(蒸馏水) 14.8mlTEMED(四甲基乙二氨) 20?l脱气10min 10% AP(过硫酸氨) 120?l总量 20.0ml』

2.探针用量

这相当于10-50fmoles的DNA探针，我们通常是最少50fmol。

3.蛋白样品用量

一般用量在2---20ug(控制在1-5?l)蛋白，总体系15ul。细胞核抽屉物浓度都比较低，组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.

4.预电泳和电泳

0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V，电泳约60分钟。注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!

5.电转运

在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!

6.紫外交联

正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!

7.化学发光反应包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.

8.化学发光图像显示两种方法:化学发光数字成像与检测和感光胶片冲印成像操作基本和Western 试验操作相当, 只是这个膜是一次性的,不能重复使用, 一定保存好图片!由于跑得是非变性凝胶,蛋白保持天然构想和活性,所以代条很可能是一块一块的而不像WB那样很规整的一条细线,这个很正常!

参考如下资料:实验设计
1.验证性EMSA
用于验证特定的序列是否可以与蛋白结合,但不能确定与探针结合的蛋白。
2.竞争性EMSA
在反应体系中同时加入未标记的探针,如果探针与蛋白的结合是特异的,与仅加入标记探针的反应相比,蛋白-探针复合物的信号会降低甚至消失。
3.超迁移EMSA
超迁移EMSA一般应该在EMSA实验已经成功的基础上进行。
如果蛋白样品不是纯化蛋白而是混合物,验证性和竞争性EMSA都不能鉴定出与探针结合的蛋白。在反应体系中加入特定的蛋白抗体,抗体与蛋白-探针复合物结合,抗体-蛋白-探针复合物的电泳迁移变慢,因此,可以确定探针是否与特定的蛋白结合。
附:蛋白DNA结合缓冲液配方(5X)
成分 用量(μL)
甘油 500
Tris(1M,pH8.0) 250
BSA(10mg/mL) 125
NaCl(5M) 30
EDTA(0.5M,pH8.0) 10
DTT(1M) 10
总体积 1000