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孔雀石绿及其代谢物残留量的测定
摘要:建立了水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的测定方法。采用中性氧化铝固相萃取小柱对鲤鱼样品进行净化,Shim-pack Scepter C18 色谱柱进行分离,岛津 LCMS-8050 串联质谱检测分析,内标法定量。对空白样品 0.5μg/kg 、1μg/kg、5μg/kg三个水平浓度加标后,按照上述前处理方法处理后上机,平行6份样品考察回收率和精密度RSD,结果显示:①孔雀石绿:0.5μg/kg 加标浓度的加标回收率为84.1%-92.0%,RSD为3.6%;1μg/kg加标浓度的加标回收率为95.0%-104.2%,RSD为3.9%;5μg/kg 加标浓度的加标回收率为 103.0%-106.6%,RSD为 2.7%;②隐色孔雀石绿:0.5μg/kg 加标浓度的加标回收率为78.8%-113.2%,RSD为13.8%;1μg/kg加标浓度的加标回收率为78.8%-89.1%,RSD为5.4%;5μg/kg加标浓度的加标回收率为72.4%-84.0%,RSD为5.0%;该方法回收率高,重现性好,适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物的测定。1. 实验部分1.1 实验仪器及耗材仪器配置:Shimadzu LC-30A 与 LCMS-8050 联用系统;色谱柱:Shim-pack Scepter C18,50×2.1 mm,1.9μm;固相萃取小柱:中性氧化铝柱 1g/6mL;1.2 分析条件UHPLC 条件色谱柱:Shim-pack Scepter C18,50×2.1 mm,1.9μm流 速:0.4 mL/min 进样量:5μL 柱 温:40 ℃流动相: A:0.1%甲酸水 B:乙腈梯度洗脱程序如下: 时间(min) | 0 | 2.5 | 3.2 | 3.21 | 4.5 |
A(%) | 60 | 0 | 0 | 60 | 60 |
B(%) | 40 | 100 | 100 | 40 | 40 |
质谱条件离子化模式:ESI,正离子扫描 扫描模式:多反应监测(MRM)碰撞气:氩气 加热气:氮气 10 L/min雾化气:氮气 3 L/min 干燥气:氮气 10 L/min接口温度: 300℃ DL 温度:250 ℃ 加热模块温度:400 ℃ 化合物参数见下表:名称 | 前体离子 | 产物离子 | Q1 Pre Bias(V) | CE(V) | Q1 Pre Bias(V) |
孔雀石绿 | 329.20 | 313.10* | -12.0 | -36.0 | -23.0 |
208.10 | -12.0 | -37.0 | -23.0 |
隐色孔雀石绿 | 331.20 | 239.10* | -12.0 | -31.0 | -17.0 |
316.10 | -12.0 | -21.0 | -23.0 |
隐色孔雀石绿-D6 | 337.20 | 240.10 | -12.0 | -33.0 | -17.0 |
孔雀石绿-D5 | 334.10 | 318.10 | -16.0 | -40.0 | -23.0 |
*定量离子对1.3 样品前处理1.3.1 样品提取称取5.00g已捣碎样品于50mL离心管中,加入200μL混合内标标准溶液(100ng/mL),加入11mL乙腈,超声振荡提取2min,8000r/min匀浆提取30s,4000r/min离心5min,上清液转移至25mL的比色管中;另取一只50mL离心管加入11mL乙腈,洗涤匀浆刀头10 s,洗涤液转入前一离心管中,用玻棒捣碎离心管中沉淀,涡旋混匀器上振荡30s,超声振荡5min,4000r/min离心5min,上清液合并至25mL比色管中,用乙腈定容至25.0mL,摇匀备用。1.3.2 样品净化移取5.00mL样品溶液加至已活化的中性氧化铝柱上,用KD浓缩瓶接收流出液,4mL乙腈洗涤中性氧化铝柱,收集全部流出液,45℃旋转蒸发至约1mL,残液用乙腈定容至1.00mL,超声波振荡5min,加入1.0mL5mmol/L乙酸铵,超声波振荡1min,样液经0.2μm滤膜过滤后供液相色谱串联质谱测定。1.4 标准溶液的配制1.4.1混合标准储备液:分别准确吸取10μL孔雀石绿和隐色孔雀石绿标准品至1mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,配制成浓度为1μg/mL的标准储备液。1.4.2混合标准储备液:准确吸取10μL孔雀石绿和隐色孔雀石绿混合标准储备液(1.4.1)至1mL容量瓶中,用乙腈稀释至刻度,配制成浓度为0.01μg/mL的标准储备液。1.4.3混合内标标准溶液:用乙腈稀释内标标准品,配制成0.1μg/mL的内标标准溶液。1.4.4精确吸取一定量的混合标准储备液(1.4.2)和混合内标标准溶液(1.4.3),用乙腈+0.1%甲酸溶液(1+1)稀释成质量浓度为0.1μg/L、0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L的标准工作溶液,每毫升中含有氘代孔雀石绿和氘代隐色孔雀石绿各2ng。2. 结果2.1 标准品的 MRM 色谱图[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]
1.0 μg/L 标准溶液的 MRM 色谱图
(1. 孔雀石绿;孔雀石绿-D5 2. 隐色孔雀石绿;隐色孔雀石绿-D6)2.2 线性关系将浓度为 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0μg/L的混合标准工作液按1.2中的分析条件进行测定,孔雀石绿以氘代孔雀石绿为内标物质计算,隐色孔雀石绿以氘代隐色孔雀石绿为内标物质计算;以浓度比为横坐标,峰面积比为纵坐标,绘制校准曲线如下图所示:[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]
孔雀石绿的标准工作曲线
[img]" style="max-width: 100%;max-height: 100%;[/img]
隐色孔雀石绿的标准工作曲线
所得校准曲线线性关系良好,线性方程及相关系数见下表。序号 | 名称 | 校准曲线 | 线性范围(μg/L) | 相关系数r2 |
1 | 孔雀石绿 | Y=0.436507X+0.0156128 | 0.1-5.0 | 0.9998455 |
2 | 隐色孔雀石绿 | Y=0.403218X-0.00873880 | 0.1-5.0 | 0.9993515 |
2.3孔雀石绿及其代谢物的回收率和精密度RSD将鲤鱼空白样品进行 0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg 浓度加标后,按照上述前处理方法处理后上机,平行6份样品考察回收率和精密度RSD,具体结果如下:目标物 | 加标浓度(μg/kg) | 回收率范围(%) | RSD(%) |
孔雀石绿 | 0.5 | 84.1-92.0 | 3.6 |
1 | 95.0-104.2 | 3.9 |
5 | 103.0-106.6 | 2.7 |
隐色孔雀石绿 | 0.5 | 78.8-113.2 | 13.8 |
1 | 78.8-89.1 | 5.4 |
5 | 72.4-84.0 | 5.0 |
3. 结论参照国标 GB/T 19857-2005,建立了水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿的测定方法。采用中性氧化铝固相萃取小柱对鲤鱼样品进行净化,Shim-pack Scepter C18 色谱柱进行分离,岛津 LCMS-8050串联质谱检测分析,内标法定量。对空白样品0.5μg/kg、1μg/kg、5μg/kg浓度加标后,按照上述前处理方法处理后上机,平行6份样品考察回收率和精密度RSD,结果显示本方法回收率高,重现性好,完全符合GB/T 19857-2005、GB/T 27404-2008标准要求,该方法适用于水产品中孔雀石绿及其代谢物的测定。