主题：【第十二届原创】超高效液相色谱-串联质谱法测定大豆中大豆异黄酮的含量

超高效液相色谱-串联质谱法测定大豆中大豆异黄酮的含量

户江涛

（农业农村部豆类产品质量安全风险评估实验室（佳木斯），黑龙江省农垦科学院测试化验中心，黑龙江佳木斯 154007 ）

摘要：采用超高效液相色谱-串联质谱法建立了检测大豆中大豆异黄酮含量的分析方法。试样经90%甲醇水提取后，6种大豆异黄酮在C₁₈色谱柱上以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相，进行液相色谱分离；质谱检测采用电喷雾正离子化模式和多反应监测模式（MRM）。结果表明，6种大豆异黄酮分别在0.01~0.5 mg/L（D、GL、G）和0.002~0.1 mg/L（De、GLe、Ge）范围内线性关系良好，相关系数（R）为0.9993~0.9998，定量限（LOQ）为0.0001 g/kg。在大豆空白样品添加浓度分别为0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）和0.2、1、2 g/kg（D、GL、G），6种大豆异黄酮的平均回收率为86.6%~96.2%，相对标准偏差（RSD）为1.07%~5.93%（n=6）。本方法简便、灵敏、抗干扰，适用于大豆中大豆异黄酮含量检测。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；大豆；大豆异黄酮

Determination of soybeanisoflavone in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry

HU Jiangtao

(Laboratory of Qualityand Safety Risk Assessment for Soybean products, Ministry of Agriculture andRural Affairs, Testing and Analysis Center of Heilongjiang Academy of LandReclamation Sciences, Jiamusi 154007,China)

Abstract：A methodwasdeveloped for the determination of soybeanisoflavone in soybean by ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry(UPLC-MS/MS). The samples were extracted by 90% methanol-water, then 6 soybean isoflavones were separated on aWaters BEH C₁₈ column with gradient elution with the mobile phase of0.1% formic acid and acetonitrile, and finally detected by positive eletrosprayionization-mass spectrometry(ESI⁺-MS/MS) in multiple reactionmonitoring(MRM) mode. The results showed the linearities of 6 soybean isoflavones were good in the concentrationrange of 0.01~0.5 mg/L（D、GL、G）and 0.002~0.1 mg/L（De、GLe、Ge）, the correlation coefficients were 0.9993~0.9998. The limitof quantification(LOQ) of soybean isoflavone was 0.0001 g/kg. At the spiked levels of 0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）and 0.2、1、2 g/kg（D、GL、G） in the blank soybean samples, the mean recovery of soybeanisoflavone was 86.6%~96.2%, andthe relative standard deviation(RSD) was 1.07%~5.93%（n=6）.This method is simple,sensitive, anti-jamming and suitable for simultaneous determination of soybean isoflavone in soybean.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry (UPLC-
MS/MS); soybean;soybean isoflavone
大豆异黄酮（soybean isoflavone）是一族化合物的统称，是大豆植物体内的一种次生代谢产物，是大豆主要活性成分之一，其母核为3-苯并吡喃酮，主要包括大豆苷、大豆黄苷、染料木苷及其相应苷元。研究表明，大豆异黄酮除具有天然抗氧化作用外，还具有降低胆固醇含量、预防多种癌症及改善妇女更年期综合征等多方面生物功效。大豆异黄酮主要存在于大豆籽实中，其总含量约为0.4~5 g/kg，其中大豆苷、大豆黄苷和染料木苷这三种含量约占总量的97%~98%，而其对应的苷元含量仅占2%~3%左右。
目前，大豆异黄酮的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法、紫外分光光度法 、质谱法（HPLC-MS/MS）等。紫外分光光度法 只能测定大豆异黄酮总量，且灵敏度不高；气相色谱法需要对异黄酮进行衍生，前处理复杂；目前，大豆异黄酮检测现有的国家标准GB/T 26625-2011 采用的是高效液相色谱法（HPLC），在实际检测过程中发现，由于紫外检测器灵敏度不高，存在个别样品中异黄酮相应苷元检测不到的情况；同时大豆提取液中含有蛋白、脂肪等杂质影响色谱柱柱效，以至于不能满足分离度要求，严重干扰低含量组分峰面积积分定量。而LC-MS/MS法质谱检测器灵敏度高，通过选定大豆异黄酮的特征离子，能有效去除上述杂质干扰，定量更加准确可靠。
目前，国内外采用LC-MS/MS法检测大豆中大豆异黄酮含量的文献很少。本文对大豆中大豆异黄酮检测的前处理方法借鉴GB/T 26625-2011，提取液改用UPLC-MS/MS测定。该方法前处理过程简便、灵敏度高、分析时间短、抗干扰能力强，适用于大批量大豆样品中大豆异黄酮含量的检测。
1 实验部分
1.1 材料与试剂
大豆苷（daidzin,记为D，以下同）、大豆黄苷（glycitin,GL）、染料木苷（genistin, G）、大豆素（daidzein,De）、大豆黄素（glycitein, GLe）、染料木素（genistein,Ge）（纯度≥99%，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，Fisher公司）；实验用水为Millipore纯水仪制备。
1.2 仪器与设备
Acquity UPLC型超高效液相色谱仪（Waters公司）；XEVO TQ-S三重四级杆质谱仪（Waters公司）；KQ-500DE型超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（IKA公司）；CR21GⅢ型高速离心机（HITACHI公司）。
1.3 大豆异黄酮标准储备液的配置
分别称取适量的D、GL、G、De、GLe、Ge标准品，用甲醇配置成质量浓度为1mg/mL标准储备液，于-18℃冰箱保存（有效期6个月），待用；使用时用10%甲醇水逐级稀释成所需浓度的混合标准工作液，现用现配。
1.4 样品前处理
提取：称取粉碎均与后的试样1.0g（精确到0.01g）于50mL聚乙烯离心管中，加入10.0 mL90%甲醇水，涡旋混合30 s后置于60℃超声波清洗器中提取30 min，在离心机中以15000 r/min离心5 min，将上清液转移至100 mL容量瓶中，残渣再加入10.0 mL90%甲醇水溶液按上述步骤提取后，合并两次上清液于100 mL容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，摇匀。
a）De、GLe、Ge的测定：取1 mL过0.22ｕm有机系微孔滤膜，供UPLC/MS/MS分析测定；
b）D、GL、G的测定：由于D、GL、G含量较高，需要将a）中过完滤膜的待测液用10%甲醇水稀释50倍后，供UPLC/MS/MS分析测定。
1.5 液相色谱及质谱条件
液相色谱：色谱柱:Waters BEH C₁₈（1.7 μm，50mm×2.1mm）；柱温：30℃；流速：0.5 mL/min；进样量：1μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序：0~0.5min，10% A；0.5~3. 0 min，10%~100% A；3. 0 ~4. 0 min，100%A，4 ~4.1.1min，100% A~10% A，4.1 ~5.0min 10% A。
质谱：离子源：电喷雾离子源( ESI ⁺ ) ；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测( MRM)；毛细管电压：3.2 kv；离子源温度：150℃；去溶剂气温度：500℃；去溶剂气流量：1000 L /h；定性、定量离子对及碰撞能量见表1。

表1大豆异黄酮的质谱参数

Table 1 MRM parameters of soybean isoflavone

Analyte	Cone/V	Parent ion/(m/z)	Daughter ion/(m/z)	Collision energy/V
D	30	417	255﹡   137	27   18
G	30	433	271﹡   153	21   50
GL	30	447	285﹡   270	25   46
De	25	255	137﹡   181	30   26
Ge	25	271	153﹡   215	30   25
GLe	25	285	242﹡   168	27   35

﹡quantitativeion
2 结果与讨论
2.1 色谱及质谱条件的优化
流动相的选择：对比了酸性体系（0.1%甲酸水溶液）与非酸性体系（纯水、乙酸铵溶液）分别与甲醇、乙腈的流动相体系组合，结果发现目标物在酸性体系中比非酸性体系响应更高、峰形更好；同时大豆提取液中含有蛋白、脂肪等杂质可能会残留在色谱柱上，影响色谱柱的使用寿命，而乙腈比甲醇体系洗脱能力更强，可以有效去这些杂质。综合考虑目标物信号强度、色谱分离效果以及除杂等因素，本研究采用0.1%甲酸水溶液+乙腈流动相体系。
质谱的选择：根据6种大豆异黄酮的分子量，用10%甲醇水配置1.0 mg/L 大豆异黄酮标准溶液直接注射到质谱中，在正离子模式下分别对各种组分进行母离子及对应子离子全扫描，最终确定的质谱条件见表1。
2.2 质谱法（UPLC-MS/MS）与色谱法（HPLC）的比较
国家标准《GB/T 26625-2011粮油检验大豆异黄酮含量测定高效液相色谱法》中规定的大豆异黄酮检测方法为HPLC法。对同一大豆样品分别采用本文UPLC-MS/MS法（MRM色谱图见图1、2）和GB/T 26625 HPLC法检测，结果表明这两种方法测定的大豆异黄酮总含量值基本一致。
由于De、GLe、Ge这三种苷元在大豆中含量很低，用HPLC法检测时，紫外检测器灵敏度不高，存在个别样品中上述三种组分检测缺失的情况；同时在实际大批量样品检测中发现，随着进样次数的增加，色谱柱柱效下降，大豆提取液中存在的蛋白、脂肪等杂质对含量低的目标物峰干扰越来越大，定量困难。研究发现，同浓度的大豆异黄酮在质谱检测器上的响应值要远远超过紫外检测器，同时质谱法可以通过选定大豆异黄酮的特征离子，有效地去除杂质的干扰，其目标物分离度不受色谱柱进样次数增加的影响，定量更加准确可靠。

图1 大豆异黄酮标准溶液（0.01mg/L）MRM色谱图

Fig.1 MRM chromatograms of soybean isoflavone standard solution at 0.01 mg/L

图2 大豆样品中大豆异黄酮MRM色谱图

Fig.2 MRM chromatograms of soybean isoflavone in soybean

2.3线性范围和定量限
吸取不同体积的大豆异黄酮标准储备液（1.3），用10%甲醇水分别配置0.002、0.005、0.01、0.05、0.1（De、GLe、Ge）和0.01、0.05、0.1、0.2、0.5（D、GL、G）的大豆异黄酮上机混合标准溶液，以各自定量离子的峰面积为Y对应质量浓度X（mg/L）做标准曲线，得到的线性方程和相关系数见表2。结果表明，大豆异黄酮标准溶液在各自浓度范围内线性良好，相关系数R为0.9993~0.9999。以10倍信噪比（S/N）计算，大豆异黄酮上机液最低定量浓度为0.001 mg/L，通过公式（1）计算得到大豆中大豆异黄酮含量，最终确定本方法大豆异黄酮的定量限（LOQ）为0.0001 g/kg。
糠氨酸质量分数计算公式：

                                                                ………………（1）

  式中：X为试样中大豆异黄酮含量，以g/kg计；C为大豆异黄酮上机浓度（mg/L）；V为定容体积（V=100）。
表2 大豆异黄酮标准溶液的线性方程和相关系数

Table 2 Linear equation and correlation of soybean isoflavone in 10% methanol-water standard solutions

Analyte	Linear range/(mg/L)	Linear equation	R
D   GL   G   De   GLe   Ge	0.01~0.5   0.01~0.5   0.01~0.5   0.002~0.1   0.002~0.1   0.002~0.1	Y=2393.6x+479.38   Y=1885x+139.66   Y=1470.9x+187.97   Y=4287.9x+442.79   Y=3521.7x-103.62   Y=1993x+122.79	0.9995   0.9999   0.9993   0.9998   0.9997   0.9998

2.4回收率和精密度
大豆中De、GLe、Ge含量较低，而D、GL、G含量较高，故本方法准确度实验分为高低浓度梯度组进行加标。
称取大豆试样1.00 g，分别添加0.01、0.05、0.2 g/kg（De、GLe、Ge）和0.2、1、2 g/kg（D、GL、G），每个水平重复6次，同时做该大豆的空白本底实验。按照1.4前处理方法处理后上机检测，计算回收率（扣除空白），结果表明：不同添加浓度下，De、GLe、Ge的平均回收率为91.7%~96.2%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.78%~5.93%；D、GL、G的平均回收率为86.6%~93.8%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.07%~3.77%。
3 结语
本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定大豆中大豆异黄酮含量的分析方法。该方法灵敏度高，线性范围宽，能同时覆盖大豆中多梯度浓度大豆异黄酮组分含量的测定。同时该方法具有较高的准确度和精密度，前处理步骤简单，分析速度快，可有效避免由于色谱柱柱效下降对最终检测结果的影响，特别适合大批量样品的检测。
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