主题：【求助】有關HPLC幾個問題?

1.移動相的峰不知道是不是都是出現在4分鐘或之前?
一般都是在5分钟以前，但会有例外。
2.條件一樣的話不同儀器會不會保留時間就有所改變?怎麼照文獻做出來的差很多
不同设备会有差别，估计会有1-2分钟
3.有時候用一樣的條件但是圖形的基線會一直往上移或往下移(斜斜的)是什麼因素造成的?要怎麼改善?
那是你的色谱柱接得不太好造成的
4.用標準品先做出檢量線再做自己的樣品就可以定量了嗎?這是什麼原理阿?
看看外标法
5.因為一些原因我HPLC樣品進去的LOOP比樣品一針的量還要大會不會影響到保留時間阿?
一般保留时间会有很小的差异，我做到过无差异
6.我的DETECTOR是DAD有三維的圖這有啥參考價值嗎?用DAD定量會比較差嗎?
DAD的很好，三D的能做峰纯度检测。精度会差一点点，没影响的

还有就是色谱柱不同，会差很远

1.不一定，但绝大多数是。要根据色谱柱填料的极性和流相溶剂的极性大小来确定。绝大多数分析的要求流相不影响组分的分析

2.条件一样色谱一样，但仪器不同就是条件不一样了啊，条件不可能绝对一样的，所以保留时间也不可能绝对一样啊。文献里的条件和实测的条件有很大差距的，结果当然也有很大差别了。
3.漏液或静电影响，或溶剂的pH没调好，流相脱气没彻底....因素很多。
4.外标法是可以的，作好标准曲线就作好浓度和响应值的回归方程，一般用y=ax+b表示，用y表示响应值（纵坐标），x表示浓度（横坐标），b是截距，a是斜率。原理是最小二乘法计算原理吧，把响应值看成随浓度变化的参数。求得标准曲线后，再通过读得的样品响应值在坐标曲线中找到对应的浓度。

5.一般不会，绝对会有，但不显著，这样进样不合规范，建议买大点的进样针或买小点的定量环

6.定性价值，三维加入了时间点上的光谱图，能根据光谱信息加强组分的确认，可以看出峰的纯度。DPDA的定量不会比紫外检测器差。

请大家指正，谢谢！

看你选用什么样的色谱柱，极性还是中等极性柱。
单选纯有机相的溶剂在分析极性物质是不科学的，乙腈水为流动相比较好点，作为离子给予体比甲醇（离子接受体）会好点，甲醇水体系会有不同的黏度变化，作为流动相体系在很多情况下不如乙腈水的。
DAD的三維圖峰純度看峰顶的地方的圆滑度和在峰的顶点位置的最大吸收波长是不是与待测组分的最大吸收波长相同

首先你的样品是否是水溶性的？
一般的C18体系都会有水啊，
你做什么项目？是分析什么物质？
我帮你看看方法

天然VE和植物甾醇的液相色谱分析
冯婷，刘华
（北分瑞利集团公司色谱仪器中心，北京，100095）
摘要：介绍了极具生物活性的天然VE和植物甾醇的高效液相色谱分析方法。该方法使用SY-8000系列仪器，搭建等度或二元低压系统对样品组分进行分离和检测，取得较好结果。
关键词：天然VE    植物甾醇    HPLC
天然VE和甾醇是人类营养的必要成分，对人体具有重要的生理活性作用，是治疗和辅助治疗一系列疾病的有效药物，在抗不育、抗癌、抗衰老、治疗冠心病、心肌梗塞、动脉硬化和血栓、溃疡及厚皮病等方面都具有重要的作用。
从植物油中直接提取而得的天然VE称生育酚混缩液（tocopherols concentrate, mixed），是α、β、γ和δ型生育酚的混合液，其中以α-生育酚的生物活性最强。若将α-生育酚生物活性记为1，则β-生育酚为0.5，γ-生育酚为0.1，δ-生育酚为0.03。而抗氧化性则是δ-生育酚最强，由强到弱顺序为δ-生育酚＞γ-生育酚＞β-生育酚＞α-生育酚。目前在植物体中发现了40种较为主要的甾醇，其中谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇含量较高，最突出的是豆甾醇具有较强的抗炎和消炎作用而直接用作为抗炎药物。采用高效液相色谱可将天然VE和植物甾醇这两种混合物进行良好的分离，便于进一步的研究及产品组分的检测。
1. 天然维生素E
1.1 仪器与试剂
    SY-8100高压输液泵，SY-8200紫外分光检测器（北分瑞利色谱中心）；K-5004在线脱气机，K-1500溶剂组织器，手动进样阀（6位3通）（BFRL-KNAUER）；SY-8000色谱反控软件；色谱纯甲醇（天津化学试剂二厂），双蒸水。
1.2 色谱条件
    参照国标GB/T 5009.82-2003《食品中维生素A和维生素E的测定》确定分析方法：
色谱柱：Kromasil C18  5μ，250mm*4.6mm
流动相：甲醇:水=98:2（V/V） 
流速：1.7mL/min 
检测波长：λ=300nm
样品浓度：1.0mg/mL，溶剂为甲醇
进样量：20μL
1.3 结果与讨论
    样品在该分析条件下得到良好的分离，高压输液泵搭建低压体系，提供稳定流量为组分的分离奠定基础；手动六通进样阀可同时进样并采集谱图，避免了保留时间的误差；反控软件直接进行各项参数的设定，操作简便。分析结果见图1。
图1  天然VE色谱图
2. 植物甾醇
2.1 仪器与试剂
    SY-8100高压输液泵，SY-8200紫外分光检测器（北分瑞利色谱中心）；K-5004在线脱气机，手动进样阀（6位3通）（BFRL-KNAUER）；SY-8000色谱反控软件；色谱纯甲醇（天津化学试剂二厂）。
2.2 色谱条件
    色谱柱：Kromasil C18  5μ，250mm*4.6mm
流动相：纯甲醇
流速：0.8mL/min 
检测波长：λ=210nm
样品浓度：0.1mg/mL
进样量：20μL
2.3 结果与讨论
    样品在等度条件下即可得到良好的分离，菜油甾醇和谷甾醇间分离度为1.0，解决了气相色谱分析中二者分离难的问题；高压输液泵可升级为制备型，进一步优化条件后即可进行四种甾醇的制备。分析结果见图2。

图2  植物甾醇色谱图

参考文献：
[1]  于世林. 高效液相色谱方法及应用（第四版）. 北京：化学工业出版社，2004.4
[2]  GB/T 5009.82-2003《食品中维生素A和维生素E的测定》
[3]  许文林. 混合植物甾醇中豆甾醇和β-谷甾醇的高效液相色谱分析. 分析测试学报，2003，22（6）：98～101

Analysis of Vitamin E and Phytosterol by HPLC
Feng Ting, Liu Hua
(BAIF Chromatograph Instrument Center)
Abstract: To analyze the chemical components of Vitamin E and Phytosterol, HPLC was used in this study. The results show that SY-8000 has good performance.
Key words: Vitamin E    Phytosterol    HPLC