主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之三）

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发表于：2008/11/24 07:32:43 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

GC/MS法测定牛尿中 -激动剂三甲基硅烷化衍生物（EEC，确证法）
β-Agonists-A Mehtod for Confirming the detection ofβ-Agonists in Bovine Urine by GC/MS in the Positive Chemical Ionisation Mode for the Trimethylsilyl Deviatives
(EEC, Cy 2.3 Confirming Method)

1 主题内容
该分析方法描述了如何确认小牛和成年牛的尿样中存在单体 -激动剂的实验操作。该分析方法是法兰西官方方法，与欧洲经济共同体残留导则（86/469/EEC）一致。

2 应用范围
该方法是为了确认在对小牛和成年牛的尿样进行 -激动剂的筛选实验中发现为阳性结果的方法。该方法用于对存在下列 -激动剂残留的确认：双氯醇胺（克喘素）clenbuterol, clenpenterol, 羟甲克喘素hydroxymethyl-clenbuterol, 沙丁胺醇salbutamol, terbutaline, 雪马特罗cimaterol, cimbuterol, 马本特罗mabuterol, mapenterol, tulobuterol, fenoterol 及 ractopamine等。
检测限定义为浓度低于1 g/L时的信躁比要 3。意识到该方法是专门用于确认已经怀疑存在某种 -激动剂的残留这一点是非常重要的。如此就可以使分析操作瞄准某个特定GC保留时间和特定质谱的化合物。

3 参考资料
Commission Decision, 93/256/EEC, laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thylostatic action. [OJ. NL.118,14.4.93.pp64-74]

Montrade, M-P., Le Bizec, B., Monteeau, F., Siliart, B. And Andre, F.(1993), Multi-Residue analysis for -agonistic drugs in urine of meat-producing animals by gas chromatography-mass spectrometry. Anal. Chim. Acta., 275,253-268

Montrade, M-P., Le Bizec, B. and Andre, F.(1992), Mehtode de recherche urinaire (screening) d’agonistes Montrade, -adrenergiques par chromatographie gazeuse couplee a la spectrometie de masse (GC/MS) en mode impact electronique. Document LDH/92/01 Lab. Dosage Hormonaux, Nantes, DGAL/SDHA/N.92-8066

Montrade, M-P., Le Bizec, B. and Andre, F.(1993), Research and identification of -agonistic drugsin biological samples by gas chromatography coupled with mass spectrometry Confirmation method in positive ion chemical ionisation. Document LDH/93/05 Lab. Dosage Hormonaux, Nantes, DGAL/SDHA/N.93-8065.

4 定义
根据以上对本方法所作的描述 -激动剂的含量是指被测定样品中 -激动剂的物质的残留量，单位为 g/kg或 g/L。

5 方法提要
本方法由6个部分组成。
⑴ 共轭物的水解
⑵ 甲醇沉降处理（任选），特别适合成年牛的脏尿处理。
⑶ 用混合固相提取（SPE）色谱法对提取物进行纯化和浓缩。
⑷ 衍生反应。
⑸ 以甲烷为反应气体用正离子化学电离模式进行GC-MS测定。
⑹ 结果的计算和评价。

6 实验材料
注意：反应试剂（包括仪器设备）的来源都应该符合要求，不过不同来源的试剂和设备可等同使用。全部试剂都必须分析纯或高于分析纯。
6.1 标准物质
6.1.1实验中使用了下列标准物质：
氯化克喘素（法兰西Interchim， Montlucon公司）
Salbutamol hemisulphate, Terbutaline hemisulphate, metoprolol tartrate 和meterproterenol hemisulphate（西格玛公司）。
Cimaterol, Clenpenterol（NBA 760）, mabuterol, fenoterol hydrobromide 和hydroxymethyl clenbuterol（NA1141）（Boehringer Ingleheim公司）。
Tulobuterol hydrochloride（Abbott公司）。
Ractopamine hydrochloride（Eli Lilly公司）。
Cimbuterol和marpenterol 由法兰西Rennes大学化学系合成。
同位素示踪原子标记的内标物质，克喘素-d6和salbutamol-d6，由RIKILT,Wageningen, The Netherlands等人赠送。有一点应该预见到，上述的标准物质必须经过DGXII检验程序的检验和测量才可以使用。
6.2 化学药品和试剂
6.2.1 Helix pomatia果汁（ -glucuronidase-arylsulfatase, Merck-4114）
6.2.2 冰乙酸
6.2.3 超纯水（ 14 M ．cm）
6.2.4 甲醇
6.2.5 乙酸乙酯
6.2.6 32 的氢氧化铵
6.2.7 1 mol/L氢氧化钾
6.2.8 1 mol/L乙酸
6.2.9 N-O-双-（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）（Regisil-270111或FLUKA-15244）。
6.2.10 甲苯分子筛（Fluka-89677）。
6.2.11 乙酸钠
6.2.12 磷酸二氢钾
6.2.13 氮气（通过硅胶干燥）。
6.2.14 高纯氦气（NSS,Carboxyque）。
6.2.15 高纯甲烷气（N55,Carboxyque）。
6.3 溶液
6.3.1 -激动剂：以甲醇为溶剂制备标准储备溶液，浓度分别为1g/L和100 g/L（6.1.1），在-18℃贮存。
6.3.2 -激动剂：以甲醇为溶剂稀释标准储备溶液（6.3.1）以制备标准工作溶液，浓度分别为10 g/L和1 g/L，在-18℃贮存。
6.3.3 2mol/L pH=5.2乙酸钠缓冲溶液，用于共轭物的水解。制备操作为溶解164g乙酸钠（6.2.11）于900mL水中（6.2.3）用冰乙酸（6.2.2）调节pH到5.2 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，使用期为1个月。
6.3.4 pH=6，0.1M的磷酸盐缓冲溶液。溶解13.6 0.1g磷酸二氢钾（6.2.12）于900mL水中（6.2.3），用1mol/L的氢氧化钾（6.2.7）调节pH值到6.0 0.1，最后用水稀释到1L，在+4℃贮存，使用期为1个月。
6.3.5 97：3（v/v）乙酸乙酯和32 的氢氧化铵混合液。100mL可做16个样品。使用前需进行搅拌或摇动，并且在后面的9.13.3步操作期间，同时接受超声波水浴的处理。

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2008/11/24 7:33:15 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7 仪器和设备
7.1 离心机。
7.2 涡旋蒸发器。
7.3 涡流混合器。
7.4 pH计。
7.5 移液管。
7.6 天平。
7.7 真空过滤系统（Vac-Elut from Analytichem International）。
7.8 超声波水浴。
7.9 磁搅拌机和摇动机。
7.10 圆锥形衍生反应小瓶。
7.11 用于衍生反应小瓶（7.10）加热的加热装置。
7.12 用于旋转蒸发系统的加热装置。
7.13 SPE（固相提取）-柱；CLEAN SCREEN DAU（Worldwide monitoring - Horsham, PA,USA and sold by Technicol, Stockport, Cheshire, UK）。这些容量为6mL的柱子，含有500mg的憎水性并具有离子交换性质的担体。
7.14 GC-MS。
7.14.1 GC；HP 5890。
毛细管柱：30 m 0.25 mm内经，固定相可以是SE-30或OV-1或HP-1，膜厚0.25 m。
进样模式：不分流进样1分钟。
进样体积：2 L。
进样器温度：250℃。
接口温度：280℃。
升温程序：
18℃/min
70℃（2 min） 200℃（0 min）

5℃/min 25℃/min
245℃（0 min） 300℃（12min）

载气：高纯氦，流量1 mL/min；压力5 psi。
7.14.2 质谱仪：HP 5971，配有UNIX计算机工作站。
正离子化学离解模式（70eV）。
离子源温度：190 5℃。
反映气体：甲烷气，调节反映气体的流量使其到达离子源内的压力为6 1 乇，符合设备的功能和条件。

8 样品和制样操作
8.1 样品的性状：即必须符合导则64/433/EEC中定义的内容此能够进行尿中残留物的测定。
8.2 样品量；样品量要大到足以完成该方法以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为10mL的血浆。
8.3 样品采集和包装的方法，必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法，必须保证样品的完整性，不能损害测试的结果。做 -激动素分析的样品，必须在低于-18℃的温度下贮存和输送。

9 操作步骤
注意：操作步骤9.1到9.20与M.Sg.v.v.的报告中报道的筛选方法是等同的。
9.1 吸取十多毫升尿样液放入一离心试管中，以3000rmp的速度离心15min后，用移ye8管移取10mL放入一带螺盖的试管中（例如象闪烁计数管那样的试管）。
9.2 往上述尿样试管中，包括2根空白尿样试管各加入60ng作内标物质的美多心安（β阻滞剂）。
9.3 往上述一根空白尿样试管中（9.2），加入40ng的tulobuterol, fenoterol和ractopamine标准物质（相当于在样品中的含量为4ppb），再加入20ng其它 -激动剂标准物质（相当于在样品中的含量为2ppb）。
9.4 往上述各个试管中加入1mL乙酸盐缓冲溶液（6.3.3），核对pH=5.2 0.3，如果有必要，用乙酸调节pH大约到5.2。
9.5 各加入50 L的Helix pomatia果汁（6.2.1），放入50℃的水浴中或烘箱内保存过夜。
以下从9.6到9.11的操作步骤，可以选择，并且可以用于成年牛的尿样。
9.6 将水解的尿样转移到一个旋转蒸发烧瓶中。
9.7 加入25mL甲醇，用旋转蒸发器和45℃的水浴蒸发甲醇。
9.8 浓缩水溶液到大约3mL。
9.9 用巴氏消毒移液管将水相转移到一根试管中，再用磷酸盐缓冲溶液分2次每次5mL洗涤旋转蒸发烧瓶，洗涤液合并到试管中。
9.10 以3500 rmp的转速离心试管大约10分钟，试管底部会出现沉淀。
9.11 如果有必要调节上清液的pH到6.0 0.3，之后直接进入9.13步的操作。
9.12 如果没有选做9.6到9.11步的操作，可直接加入4mL磷酸盐缓冲溶液（6.3.4）到水解后的样液中，最后溶液pH值调节到6.0，体积到15mL。
9.13 色谱柱萃取。
9.13.1 将色谱柱至于一种真空洗脱系统之上，分别用2mL甲醇，2mL水（6.2.3）和2mL磷酸缓冲溶液（6.3.4）成功地洗涤柱子。
9.13.2 用巴氏消毒的移液管，将清亮的提取溶液（9.11或9.12）转移至色谱住的顶部，稍微施加一点负压（约为12cm Hg柱）小心地抽吸色谱柱。
9.13.3 用40cm Hg柱的负压，1mL 1mol/L的乙酸（6.2.8）洗涤柱子到干，最后用6mL甲醇和较强的负压洗涤柱子。
9.13.4 在进行9.13.3步的操作期间，将乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液（6.3.5）放在一个超声波水浴上中混合均匀待用。
9.13.5 用上一步混合均匀的乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液，洗脱柱子上的待分析成分。
9.14 在通氮气流的情况下，用旋转蒸发器和加热块，温度设置为40 5℃，蒸发上一步的洗脱液。
9.15 用200 L甲醇，剧烈涡旋摇动溶解蒸发残渣。
9.16 将溶解的溶液转移到一个反应玻璃小瓶中。
9.17 再用200 L甲醇，剧烈涡旋摇动溶解剩余的蒸发残渣。
9.18 用加热块温度设置为40 5℃蒸发甲醇至干。
9.19 衍生反应
9.19.1 加入50 L BSTFA（6.2.9）并进行涡旋混匀。
9.19.2 将衍生反应小瓶放入温度为75 5℃的加热块中加热90分钟。
9.19.3 将衍生反应小瓶转移到一个温度为45 5℃的加热块中，让小瓶和加热块冷却到室温（25℃）后，通氮气流蒸发至干。
9.19.4 加入25 L甲苯（6.2.10）剧烈涡旋混匀小瓶。
9.19.5 小瓶可以贮存在 +4℃ 的冰箱内。
9.20 以2 L的进样体积（9.19.5）注入GC-MS。
9.21 GC-MS以正离子化学离解模式运行，搜寻怀疑存有 -激动剂的4种主要的特征离子。经过衍生化反应的 -激动剂的主要特征离子的保留时间列在表1中。
表 1
-激动剂
名称 N RT
MIN M + H M-15 M-89 其它加合物
Tulobuter-ol 1 9.43 300 284 210 328
Mabuterol 1 10.61 383 367 293 363 411
Mapenterol 1 11.42 397 381 307 377 425
Terbutali-ne 3 12.29 442 426 352 356 470
Clenbuter-ol 1 12.56 349 333 259 377
Cimaterol 1 12.69 292 276 202 320
332
Cimbuterol 1 12.97 306 290 216 334
346
Salbutamol 3 13.03 456 440 366 394
369
350
Cimaterol 2 13.41 364 348 274 292 392
404
Metoprolol 1 13.49 340 324
Clenpente-rol 1 13.63 363 347 273 391
Cimbuterol 2 13.66 378 362 288 306 406
418
Hydroxyme-thyl-clenbuter-ol 2 15.30 437 421 347 313
387 465
Fenoterol 4 20.73 592 576 502 236
412
357
Ractopami-ne 3 20.88 518 502 428 250
456

表中的N代表三甲基硅烷基的数目，RT是在LDH，Nantes所做的一次分析中记录到的保留时间。加合物是由于使用了作选择性离子实验的反应气体而诱导的离子。
注意：经验表明，至少是这4种离子，要依靠正离子化学离解模式（PCI）质谱方法，来获得足够的信息是极少有可能的。所以，对使用电子轰击离解模式（EI）来获得质谱信息的做法，也给予了推荐和说明（关于那种方法，也使用相同的提取步骤和相同的气相色谱条件，但只是EI检测模式，具体情况参看Sg2.1）。

10 对结果的解释
10.1 分析结果的合法性；欧共体第256号决议中关于结果的标准表述都应该做到，尤其是对下列内容。
10.1.1 在适当基质中标准被分析物的三甲基硅烷衍生物，与被怀疑的相应的 -激动剂的三甲基硅烷衍生物，它们的相对保留时间，必须是相同的。
10.1.2 被选择离子对基峰的相对强度，与空白尿样中添加的标准物的相应离子对基峰的相对强度，必须是相同的。
10.1.3 内标标准物的离子（metoprolol-单体三甲基硅烷衍生物离子），必须出现在正确的相对保留时间的位置上。
10.1.4 添加有内标标准物的空白尿样的分析结果，必须确保没有来自GC-MS系统中残留 -激动剂的任何贡献，即 -激动剂的含量不能超过添加量。这也是对系统是否有污染的一种考核。

11 特殊情况

12 实验操作注意事项
三甲基硅烷衍生物的保留时间稍微与筛选方法中的保留时间有点不同。

13 质量控制
参看 -激动剂RMS手册第8节的详细内容。

14 实验报告

15 缩略语列表
全面的缩略语列表参见第12节的附录I。

16 检验流程图

尿样甲醇沉淀用固相提取色谱提取

PCI模式
结果解释 GC/MS 三甲基硅烷衍生
甲烷气

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