主题:【分享】欧盟兽药检测方法(之二)

浏览0 回复2 电梯直达
一道黑
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
GC/MS法测定牛肝、肾和肉中 -激动剂的三甲基硅烷衍生物(EEC,筛选法)
GC/MS法测定牛肝、肾和肉中 -激动剂的三甲基硅烷衍生物(EEC,筛选法)


β-Agonists-A Screening Method for the Detection ofβ-Agonists in Bovine Liver,Kidney and Meat by GC-MS in the ElectronImpact Mode for the Trimethylsilyl derivatives
(EEC, Screening Method Sg2.4)

1 主题内容
这是一种多残留分析方法,描述了残留于小牛和成年牛的肝、肾和肉的样品中,12种单体 -激动剂测定方法。该方法是法兰西的官方方法,与欧共体残留导则(86/469/EEC)的原则保持一致。

2 应用范围
该方法用于日常筛选分析小牛和成年牛的肝、肾和肉样品,测定样品中的clenbuterol, clenpenterol, hydroxymethyl-clenbuterol, salbutamol, terbutaline, cimaterol, cimbuterol, mabuterol, mapenterol, tulobuterol, fenoterol和ractopamine等 -激动剂的残留量。方法的检出限被定义为当信躁比 3时,大多数 -激动剂的检出低于2 g/kg。

3 参考资料(略)

4 定义
-激动剂的含量是指被测定样品中 -激动剂的物质的量,根据以上对本方法所作的描述,它应该表述为 g/kg样品(肝、肾和肉)。

5 方法原理
本方法由8个部分组成。
⑴ 样品用Stomacher均质器和超声波设备均质。
⑵ 共轭物的水解。
⑶ 酸沉淀。
⑷ 液液萃取。
⑸ 用混合固相色谱提取法对萃取溶液进行净化和浓缩。
⑹ 衍生反应。
⑺ 用GC-MS电子轰击源进行测定。
⑻ 结果的计算和评价。

6 实验材料
注意:反应试剂(包括仪器设备)的来源都应该符合要求,不过不同来源的试剂和设备可以等同使用。全部试剂都必须分析纯或高于分析纯。
6.1 标准品
氯化克喘素
Salbutamol hemisulphate, Terbutaline hemisulphate,metoprolol tartrate。
Cimaterol, Clenpenterol(NBA 760), mabuterol, fenoterol hydrobromide ,hydroxymethyl clenbuterol(NA1141)(Boehringer Ingleheim公司)。
Tulobuterol hydrochloride(Abbott公司)。
Ractopamine hydrochloride(Eli Lilly公司)。
Cimbuterol,marpenterol 由法兰西Rennes大学化学系合成。
6.2 化学药品和试剂
6.2.1 Helix pomatia果汁( -glucuronidase-arylsulfatase, Merck-4114)。
6.2.2 冰乙酸
6.2.3 超纯水: 14 M .cm。
6.2.4 甲醇
6.2.5 乙酸乙酯
6.2.6 32 的氢氧化铵
6.2.7 1 mol/L氢氧化钾
6.2.8 1 mol/L乙酸
6.2.9 N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)(Regisil-270111或FLUKA-15244)。
6.2.10 甲苯分子筛
6.2.11 乙酸钠
6.2.12 磷酸二氢钾
6.2.13 氮气:通过硅胶干燥
6.2.14 高纯氦气
6.2.15 70 高氯酸
6.2.16 氯化钠
6.2.17 异丙醇
6.2.18 氮气
6.3 溶液
6.3.1 -激动剂:以甲醇为溶剂制备标准储备溶液,浓度分别为1g/L和100 mg/L(6.1.1),在-18℃贮存。
6.3.2 -激动剂:以甲醇为溶剂稀释标准储备溶液(6.3.1)以制备标准工作溶液,浓度分别为10 g/mL和1 g/mL,在-18℃贮存于黑暗中。
6.3.3 0.2mol/L pH=5.2乙酸钠缓冲溶液,用于共轭物的水解。制备操作为溶解16.4g乙酸钠(6.2.11)于900mL水中(6.2.3)用冰乙酸(6.2.2)调节pH到5.2 0.1,最后用水稀释到1L,在+4℃贮存,使用期为1个月。
6.3.4 pH=6,0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。溶解13.6 0.1g磷酸二氢钾(6.2.12)于900mL水中(6.2.3),用1mol/L的氢氧化钾(6.2.7)调节pH值到6.0 0.1,最后用水稀释到1L,在+4℃贮存,使用期为1个月。
6.3.5 以97﹕3(v/v)混合乙酸乙酯和32 的氢氧化铵。每100mL可做16个样品。使用前搅拌或摇动,并且在后面的9.13.3步操作期间,同时接受超声波水浴的处理。
6.3.6 0.1 mol/L高氯酸(PCA)沉淀剂:用水稀释8.6mL 70 高氯酸到体积为1升。
6.3.7 1 mol/L乙酸:用100 mL水稀释5.6 mL的冰乙酸(6.2.2)。
6.3.8 体积比为40:60的异丙醇和乙酸乙酯混合溶液:混合400 mL的异丙醇和600 mL的乙酸乙酯。

为您推荐
您可能想找: 气相色谱仪(GC) 询底价
专属顾问快速对接
立即提交
可能感兴趣
一道黑
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
7 仪器设备
7.1 离心机。
7.2 旋转蒸发器。
7.3 水平振荡器。
7.4 Stomacher(Cofralab-07555526)和塑料袋(Cofralab-07556952)。
7.5 超声波水浴。
7.6 搅拌机或碎肉机。
7.7 真空过滤系统(Vac-Elut from Analytichem International)。
7.8 超声波探头(Cofralab-07580740)。
7.9 磁搅拌器或磁振荡器。
7.10 衍生反应用的圆锥型反应小玻璃瓶 。
7.11 加热圆锥型反应小玻璃瓶(7.10)用的加热块。
7.12 配有吹氮气装置的旋转蒸发系统。
7.13 固相提取柱(SPE-柱):CLEAN SCREEN DAU IM6(Worldwide monitoring - Horsham, PA, USA and sold by Technicol, Stockport, Cheshire, UK)。这些柱子含有1000 mg的混合相担体,具有憎水性和离子交换的性质。
7.14 GC-MS
7.14.1 气相色谱仪:HP 5890。
毛细管色谱柱:30 m 0.25 mm内径,具有0.25 m膜厚的SE-30固定相。
进样模式:不分流进样超过1min。
进样体积:2 L。
进样器温度:250℃;接口温度:280℃。
升温程序:
70℃(2min) 18℃/min 200℃(0min) 5℃/min 245℃(0min)25℃/min 300℃(12 min)
载气:高纯氦,流量1 mL/min;压力5 psi。
7.14.2 质谱仪(MS):HP 5971,具有UNIX计算机工作站。
电子轰击离解模式:70 eV。
离子源温度:190℃ 5℃。
离子源真空度:30-40毫乇。
离子质量:见表1。

表 1
-激动剂的名称 N RT(分) 选择离子 分子离子
Tulobuterol 1 9.34 86,194,284 299
Mabuterol 1 10.36 86,277,296 382
Mapenterol 1 11.04 100,277,296 396
Terbutaline 3 11.67 86,356 441
Clenbuterol 1 12.02 86,243,262(264) 348
Cimaterol 1 12.14 72,219 291
Salbutamol 3 12.27 85,369 455
Cimbuterol 1 12.36 72,291 305
Cimaterol 2 12.62 27,223 363
Metoprolol(I.S) 1 12.7 86,291 339
Cimbuterol 2 12.8 100,243,262(264) 377
Clenpenterol 1 12.86 174,243,262 362
Hydroxymethyl-
clenbuterol(NA
1141) 2 14.05 322,256,412 436
Fenoterol 4 18.39 250,267 591
Ractopamine 3 18.63 517
表中的N代表三甲基硅烷基的数目,RT是在LDH,Nantes所做的一次分析中记录
到保留时间。


8 样品和取样程序
注意:留意6.3.1节和国际标准化组织文件78/2-1982(E)以及由文件2052/Ⅵ/84-EN 的附件Ⅱ导出的下列通则。
8.1 样品性状:即必须符合导则64/433/EEC中定义的内容,使能够进行肝、肾和肉样中残留物的测定。
8.2 样品量:样品量要大到足以完成测定以及重复测定的要求。本方法测定β-激动素作一次测定时所要求的样品量为10g。
8.3 样品采集和包装的方法:必须使实验室易于鉴别和使用。
8.4 样品的包装、贮存和运输的方法:必须保证样品的完整性,不能影响测试的结果。
在48小时内就做 -激动素分析的样品,必须贮存于冰箱内。48小时以后才做分析的样品,必须在低于-18℃的温度下贮存。

9 操作步骤
9.1 分割约15g的初级样品,放进一台搅拌机或碎肉机中,使样品绞碎。但对肝样品来说,可不必这样做。
9.2 称出10 1 g的碎样,放入一个Stomacher口袋中,加进去15 mL pH=5.2的乙酸盐缓冲溶液(6.3.3),均质5分钟。
9.3 将袋中内容物转移到一个25 mL的烧瓶中。
9.4 将超声波探头(7.8)伸进烧瓶中,超声0.5秒钟,等待5秒钟后再超声0.5秒钟。对肝和肾样品重复这一操作10次(总时间为50秒),对肉样品重复这一操作20次(总时间为100秒)。
9.5 添加120 ng的metoprolol作为内标物质加入肝、肾和肉样中,包括空白的肝、肾和肉的样品,含量相当于12 g/kg样品。
9.7 取出一个肝、肾和肉的空白样品,添加120ng的metoprolol标准物质(相当于样品中含量为12 ppb),80 ng的tulobuterol, fenoterol, 和ractopamine标准物质(相当于样品中含量为8 ppb),40 ng的其它 -激动剂标准物质(相当于样品中含量为4 ppb)。
9.8 加50 L的Helix pomatia果汁(6.2.1),放置于50℃(42 52℃)的水浴中或烘箱内,放置过夜。
9.9 将经过水解的肝、肾和肉样品转移到一个聚乙烯离心管中。
9.10 加入10 mL 0.1 mol/L的高氯酸(6.3.6),混合均匀并用70 的高氯酸(PCA)(6.3.15)调节pH值到1 0.3。
9.11 以7000转/分的转速离心25分钟后,将上清液转移到一根玻璃离心管中。
9.12 用氢氧化铵溶液(6.2.6)调节pH值到9.5 0.3。
9.13 用氯化钠饱和水相。
9.14 加25 mL 的异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液(6.3.8),置于一个水平振荡器上振荡15分钟。
9.15 以3000-4000转/分的转速离心15分钟。
9.16 转移有机相到一个250 mL的旋转蒸发烧瓶中。
9.17 再用15 mL的异丙醇和乙酸乙酯的混合溶液(6.3.8),提取水相一次,合并有机相。
9.18 在一个旋转蒸发器上,以45 5℃的温度,蒸发有机相至干。
9.19 以8 mL的磷酸盐缓冲溶液(6.3.4)使蒸发残渣成为悬浮液后,转移到一根溶血用的试管中,再用 4 mL的磷酸盐缓冲溶液洗涤烧瓶后,并入刚才的溶血用的试管中。
9.20 以2000-3000转/分的转速离心15分钟。
注意:这一步操作是很重要的,当旋转蒸发操作之后出现了固体残渣时。
9.21 将液相倾入一根试管中,再加入3mL磷酸盐缓冲溶液(6.3.4)。
9.22 固相提取(SPE)柱提取。
9.22.1 将色谱柱至于一种真空洗脱系统之上,分别用4mL甲醇,4mL水(6.2.3)和4mL磷酸缓冲溶液(6.3.4)依此洗涤柱子。
9.22.2 用巴氏消毒的移液管,将清亮的提取溶液转移至色谱住的顶部,稍微施加一点负压(约为5cm Hg柱)小心缓慢地抽吸色谱柱。此步操作至少需要10 分钟。
9.22.3 用40 cm Hg柱的负压,2 mL 1M的乙酸(6.2.8)洗涤柱子到干后至少15分钟,
最后用12 mL甲醇和较强的负压洗涤柱子至干后至少10分钟。
9.22.4 在进行9.22.3步的操作期间,将乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液(6.3.5)放在一个超声波水浴中混合均匀待用。
9.22.5 用12 mL上一步混合均匀的乙酸乙酯和氢氧化铵混合溶液,洗脱柱子上的待分析成分。
9.23 通氮气在温度为40 5℃的加热块上蒸发洗脱液。
9.24 加入200 L甲醇,剧烈涡流摇动,溶解蒸发残渣。
9.25 将溶液转移至一个反应玻璃小瓶中。
9.26 再用100 L甲醇溶解上一步未溶解完全的残渣,溶液合并进反应玻璃小瓶中。
9.27 在温度为40 5℃的加热块上蒸发甲醇至干。
9.28 衍生化反应。
9.28.1 加入50 L的N-O-双-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA),并剧烈涡流摇动。
9.28.2 将反应小瓶放置在75 5℃ 的加热块上放置90 15分钟。
9.28.3 将反应小瓶转移至一个温度为40 5℃ 的加热块上,让小瓶和加热块冷却到室温(25℃)后,通氮气流蒸发至干。
9.28.4 加入25 L甲苯(6.2.10)剧烈涡流摇动溶解蒸发残渣。
9.28.5 小瓶可以贮存于温度为 +4 ℃的冰箱内。
9.29 注射2 L上一步操作中的溶液进入GC-MS
9.30 GC-MS仪器分析系统。
GC-MS仪器分析系统以选择性离子监视运行, -激动剂衍生物的保留时间列举在7.14.2的表1中。

10 对结果的分析
10.1 分析结果的合法性;欧共体第256号决议中关于结果的标准表述都应该做到,尤其是对下列内容。
10.1.1 在适当基质中标准被分析物的三甲基硅烷衍生物,与被怀疑的相应的 -激动剂的三甲基硅烷衍生物,它们的相对保留时间,必须是相同的。
10.1.2 被选择离子对基峰的相对丰度,与空白肝、肾和肉样中添加的标准物的相应离子对基峰的相对丰度,必须是相同的。
10.1.3 内标标准物的离子(metoprolol-单体三甲基硅烷衍生物离子),必须出现在正确的相对保留时间的位置上。
10.1.4 添加有内标标准物的空白肝、肾和肉样的分析结果,必须确保没有来自GC-MS系统中残留 -激动剂的任何贡献,即 -激动剂的含量不能超过添加量。这也是对系统是否有污染的一种考核。

11 特殊事例

12 方法注意点

13 质量控制
参看关于 -激动剂的RMs详细手册的第8节的内容。

14 检验报告

15 缩略语列表
一分全面的缩略语列表放在附件I的第12节。

16 实验流程图

肝,肾,肉样品 (均质) ——————→ 高氯酸沉淀 ——————→ 提取

1.溶剂液液分配萃取
2. 固相提取柱色谱

计算结果 ←——— GC-MS ←——— 三甲基硅烷化衍生
yuduoling
结帖率:
100%
关注:0 |粉丝:0
新手级: 新兵
不错的资料,要是作为附件放在一个贴子里供下载就更好了.多谢分享
猜你喜欢最新推荐热门推荐更多推荐
品牌合作伙伴