主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十八）

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发表于：2008/11/28 07:26:45 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱法（HPLC）确证和测定猪肾或肉组织中的磺胺二甲嘧啶残留量
(EEC,确证法)

Sulphadimidine-Confirmation and Determination of Sulphadimidine in Pig Kidney or Diaphragm Musle Tissue by HPLC
（EEC，Cy 3.2 Confirming Method）

安全操作注意事项及急救
穿戴防护服和防护器械。

1．引言
本方法描述了对猪肾和膈肌组织中磺胺二甲嘧啶含量的确证方法。本方法为北爱尔兰的官方正式方法，不同于UK兽药中心实验室使用的HPLC方法（见Cy3.3）。
磺胺二甲嘧啶又称Sulphamethazine，是抗微生物药物磺胺类的一种，在动物性产品中广泛使用，且通常被以100 g/t的水平添加到猪饲料中，残留和超标现象在许多国家已有报道。

2. 主题内容和应用范围
本方法用于检测猪肾或膈肌组织中磺胺二甲嘧啶的总量。其最小检测限定义为空白测定噪声的3倍，即0.05mg/kg 。每工作日可分析12个肾或膈肌样品，其中包括两个添加样品。

3．参考文献
93/256/EEC委员会决议，规定了使用激素或甲状腺抑制物的残留物的测定方法。（OJ.No.L.118,14.4.93.pp 64-74）
ISO标准78/2-1982标准制定—第二部分，化学分析标准。
Method based on standard operating procedure SOP B10 17 V.1,(1988) for the confirmation determination of sulphamethazine in porcine tissue by HPLC;-Veterinary Sciences Division, Stoney Road,Stormont, BELFAST BT4 3SD
Aerts, M.M.l.,Beek, W.M.J. and Brinkman, U.A.Th.(1988). Monitoring of veterinary drug residues by a combination of continuous flow techniques and column –switching HPLC. I. Sulphonamides in egg,meat and milk using post-colume derivatization with dimethylaminobenzaldehyde. J. Chromat. 435,97-112

4. 定义
磺胺二甲嘧啶含量是用于表述按照所描述的方法，不管其化学形态如何确证检出的磺胺二甲嘧啶的量，并以μg/kg表示。

5. 方法提要
该方法包括5个步骤
—在缓冲溶液中均质猪肾样品；
—用有机溶剂提取磺胺二甲嘧啶；
—在正已烷与甲醇/醋酸水溶液中分配磺胺二甲嘧啶；
—用HPLC柱后衍生化检测；
—根据标准曲线内插法计算磺胺二甲嘧的量，特别是对于组织样品，应考虑磺胺二甲嘧啶添加回收率。

6 仪器及试剂
注意：在方法中所引用的试剂（包括仪器）的产地、型号是适用的，其它产地、型号试剂（仪器）可等同使用。
6.1 试剂
6.1.1 氯仿
6.1.2 甲醇（HPLC级）
6.1.3 丙酮
6.1.4 正已烷
6.1.5 用7.16装置制备的去离子水
6.1.6 N,N-二甲基-氨基苯甲醛-Ehrlichs 试剂
6.1.7 冰醋酸
6.1.8 磺胺二甲嘧结晶钠盐（）
6.2 溶液
6.2.1 50%甲醇-水溶液：V/V,用去离子水(6.1.5)
6.2.2 50%甲醇的2%醋酸溶液：在250mL 容量瓶中加入125mL甲醇和5mL 冰醋酸，用水稀释至刻度并混匀。
6.2.3 N,N-二甲基-氨基苯甲醛试剂：
醋酸(6.1.7) 125mL
甲醇(6.1.2) 75mL
去离子水(6.1.5) 50mL
N,N-二甲基-氨基苯甲醛（6.1.6） 3.75g
在加入N,N-二甲基-氨基苯甲醛以前，用（7.4）描述的装置脱气2min。
6.2.4 2%醋酸溶液：
醋酸(6.1.7） 10mL
去离子水(6.1.5) 490mL
6.2.5 HPLC流动相：
2%醋酸(6.2.4） 325mL
甲醇(6.2.2) 175mL
脱气2min。
6.2.6 冲洗溶液：在1L的量筒中，加入800mL甲醇和200mL水，混合后按6.2.3进行脱气。
6.2.7 同体积混合氯仿和丙酮
6.3 标准溶液
6.3.1 标准贮备液：
精密称取磺胺二甲嘧啶（6.1.8）于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并释释至刻度，浓度为1mg/mL。
6.3.1.1 中间标准溶液Ⅰ：移取1mL标准贮备液，用甲醇稀释至10mL容量瓶中，浓度为100μg/mL，。
6.3.1.2 中间标准溶液Ⅱ：移取1mL标准贮备液，用甲醇稀释至100mL容量瓶中，浓度为10μg/mL，。
6.3.1.3 标准工作液：移取1mL中间标准溶液Ⅰ(6.3.2.1），用50%甲醇的2%醋酸溶液(6.2.2）溶解，浓度为1μg/mL，当天使用并储存于+4℃。

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2008/11/28 7:27:02 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1 托盘天平
7.2 分析天平
7.3 磁力搅拌器
7.4 脱气装置
7.5 电冰箱+4℃
7.6 通风橱
7.7 试管，10mL，圆底具磨口塞
7.8 圆底烧瓶，150mL
7.9 聚乙烯瓶，125mL，广口
7.10 刻度玻璃吸管，10mL和25mL
7.11 量筒，250mL和1L
7.12 10mL和100mL容量瓶
7.13 巴斯德吸管
7.14 色谱用微型小瓶200μL
7.15 水泵
7.16 Millipore R060反渗透和milli Q 去离子水系统
7.17 均质器
7.18 离心机
7.19 过滤装置，布氏漏斗
7.20 色谱用滤纸（7.0cm）
7.21 超声水浴器
7.22 HPLC系统
7.22.1 Waters 型501泵
7.22.2 Waters Model 455LC 分光光度计，波长：450nm
7.22.3 色谱微处理机
7.22.4 Whatman Paticil 50DS-3色谱柱：25cm×4.6mm内径
7.22.5 自动进样器，配有50μL进样针
7.22.6 柱后衍生化反应器：特氟隆管（10ft×0.023ins i.d）,死体积T-piece 混合室。

8 样品和取样程序
有关要求见ISO文件78/2-1982 6.3.1节，下列注释引自2052/VI/84EN附录Ⅱ和EEC 93/256。
8.1 样品的性状：样品应符合64/433/EEC指令中测定肉品中药物残留的要求。如无此类样品，生物体液或粪便可组成测定残留的样品。
8.2 样品量：样品量应满足测定方法及复验所需量的要求。
8.3 样品的保存和包装必须达到在实验室中正确辨识的要求。
8.4 样品的包装、贮存以及运输必须保持样品的完整性，并且不对检验结果造成任何偏差。检验磺胺二甲嘧啶的样品必须存放在-18℃以下。

9. 测定步骤
9.1 所有样品单独制备
9.2 称取5g±0.02g 新鲜组织于125mL聚乙烯瓶(17.9)中。
9.3 用3×5g阴性结果的样品制备控制样品，如下添加：
a.不加任何物质
b.100μL中间标准溶液Ⅱ（6.3.1.2）
c.200μL中间标准溶液Ⅱ（6.3.1.2）
9.4 于所有样品加入50mL氯仿-丙酮混合液(1+1）（6.2.7）。
9.5 加盖，然后高速均质约1min。
9.6 用水泵进行抽滤。
9.7 再加入10mL氯仿-丙酮混合液冲洗,并如9.6所示进行抽滤。
9.8 合并滤液并转移至100mL梨型瓶中，用旋转蒸发器于30℃去除溶剂。
9.9 加入2mL 50%甲醇的2%醋酸溶液和6mL正已烷溶解残渣。轻轻地旋动溶解，分配脂肪到正已烷层中。勿振动，否则将产生乳浊液。
9.10 将样液转移到10mL试管中（7.7）,于2000rpm离心10min,弃去上层，移取200μL底层水溶液于HPLC小瓶中（7.14）供HPLC分析。
9.11 HPLC
9.11.1 紫外检测器波长为450nm（7.22.2）。
9.11.2 色谱柱温：室温。
9.11.3 流动相（6.2.5）流速为1mL/min，运行30min。以0.5mL/min流速引入柱后衍生化试剂，再运行30min。
9.11.4 进样50μL预先制备的标准工作液（6.3.1.3）校准系统，直至获得110±10mm峰高。
9.11.5 对每一个提取样液（9.9）进样50μL，每进4个样品后交叉运行一次1μg/mL的标准工作液（6.3.1.3），每个样品约运行10min，磺胺二甲嘧啶的保留时间是8min。
9.11.6 如果在样品中发现与标准物质色谱峰的保留时间相似的色谱峰，则混合等体系的标准溶液和样品溶液，重新进样分离。以检查色谱峰流出的重叠情况。
9.10.7 分析测试完毕后，用80%（V/V）甲醇-水，以0.5mL/min的流速通过系统过夜。当不使用时,在柱内应注入80%甲醇-水。

10 结果计算
用下式计算样品中磺胺二甲嘧啶的含量：

S(h) × C(Std)
C(s) = ——————————
Std(h)

式中：　C(s) —— 样品中磺胺二甲嘧啶的含量，mg/kg
S(h) —— 样品的峰高
Std(h) —— 标准品的峰高
C(std) —— 磺胺二甲嘧啶标准溶液的浓度，在该提取液中，1mg/L的标准工作液
相当于0.4mg/kg (C(std))

10.1 确证数据
10.1.1 肝
阴性空白样品，被添加0,0.2,0.4mg/kg 的磺胺二甲嘧啶，在连续的三天内进行分析，其回收率为：

天肾
(0.2mg/kg)
平均 SD CV 肾
(0.4mg/kg)
平均 SD CV 肌肉
(0.2mg/kg)
平均 SD CV 肌肉
(0.4mg/kg)
平均 SD CV
1
2
3 76 ± 6.7 8.8
79 ± 8.7 10.9
84 ± 8.1 9.7 84 ± 6.0 7.2
84 ±10.8 12.7
83 ± 6.4 7.7 86 ± 3.3 3.9
82 ± 7.8 9.5
77 ± 3.9 5.1 83 ± 4.5 5.4
77 ± 2.9 3.7
76 ± 3.9 5.1
总计 80 ± 7.8 9.8 84 ± 7.7 9.2 82 ± 5.0 6.2 79 ± 3.8 4.7

11. 特殊事例

12. 方法注意点
其它磺胺类药物在该HPLC条件下的保留时间为：
成分保留时间
磺胺二甲嘧啶 8.4
磺胺胍 4.1
磺胺 4.2
磺胺噻唑 5.9
磺胺嘧啶 6.0
磺胺吡啶 6.2
磺胺甲基异恶唑 10.5
磺胺邻三甲氧嘧啶 12.0
磺胺间二甲氧嘧啶 23.8
磺胺喹恶琳 29.3

13.质量控制
猪组织标准物质的制备和确证工作已处于最后阶段，并由VRL，Belfast 实验室制备。

14. 检测报告

15. 缩写语(略)
见手册中12节附录1中缩写

16.检验流程图
组织样品 → 均质 → 溶剂提取 → 分配 → HPTLC → 计算结果

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