主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十六）

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发表于：2008/11/28 07:23:10 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

欧盟兽药检测方法（之十五）
Chlorampheniol-HPLC Analysis of chloramphenicol in Milk
Cy3.7

安全操作注意事项急救:
安全
有机溶剂－所有有机溶剂均应被看作有潜在危险的物品，在操作均应在通风橱内进行。

引言
氯霉素(CAP)是具有完善作用的抗生素常作为兽药用于治疗和预防。欧盟委员会规定在蛋鸡和乳牛上不得使用氯霉素(见第2节)。

1. 主题内容
欧盟(EEC)对氯霉素制定了限制使用的规定。为了确保农场主在蛋鸡和乳牛中不再使用氯霉素。同时为了监控和筛选检测，特制定本检测方法。如果筛选呈阳性，则必须进一步确证检验。

2. 应用范围
本方法适用于牛奶中的氯霉素残留物确证检验，UHT灭菌牛奶的检测限为小于1μg/L或小于μg/kg。

3. 参考文献
Commission Decision, 93/256/EEC, down the methods for detecting rseidues of Substances having a hormond of thyrostatic action. ［OJ.No L.118, 14.4.93.pp 64-74］
ISO Standard 78/2-1982 Layout for standards-Part 2:Standard for chemical Analysis.
ISO Standrd 5725(1986)
Determination of chloramphenicol in milk by high performance liquid choromatograply. CNEVA, Lab. des Medicaments Veterinaires, Fougeres, Document no. UCM/90/04

4. 定义
氯霉素含量是指按本法测得的牛奶中氯霉素的量，并以mg/L表示。

5. 方法提要
该方法包括3个步骤
—乙酸乙酯提取牛奶样品
—三氯甲烷-正已烷净化提取液
—高效液相色谱(HPLC)法定量。C18柱, UV检测(278nm)。
6. 材料
6.1 化学试剂
6.1.1 乙酸乙酯：分析纯，重蒸馏。
6.1.2 甲醇：分析纯。
6.1.3 三氯甲烷：分析纯。
6.1.4 正己烷：分析纯。
6.1.5 乙腈：HPLC纯。
6.1.6 37%盐酸：分析纯，配制成5mol/L溶液。
6.1.7 磷酸氢二铵，配制成0.0055mol/L溶液。
6.1.8 超纯水：电阻率大于18M .cm, 经活性炭和0.45μm滤膜过滤。
6.1.9 氯霉素: 纯度大于99%。
6.1.10 不含任何CAP的牛奶控制样。
6.1.11 溶液见6.16和6.17。
6.1.13 氯霉素标准品
6.1.13.1 标准储备溶液：500mg/mL氯霉素甲醇溶液，贮于4℃，至少可保存三个月。
6.1.13.2 中间标准溶液：移取标准储备溶液用水稀释成5-50μg/mL的中间标液，贮于4℃，至少可保存两周。
6.1.13.3 标准工作溶液：用水稀释中间标准溶液，分别配制成9个系列的标准工作溶液，浓度为5，10，25，50，100，125，250，500，1250，2500mg/mL。

7. 仪器设备
7.1 玻璃器皿
7.1.1 刻度移液管：1mL，5mL和25mL。
7.1.2 旋盖离心管：50mL。
7.1.3 玻璃溶血管：5mL。
7.1.4 圆底烧瓶：25mL或50mL。
7.1.5 容量瓶：20mL，25mL，50mL，100mL。
7.1.6 硅胶塞：用于离心管和均质管。
7.1.7 聚乙烯塞：用于玻璃器皿。
7.1.8 玻璃移液管
7.2. 仪器
7.2.1 具塞梨形抽吸系统：可接玻璃移液管。
7.2.2 自动加液器：100μL，1000μL，5000μL。
7.2.3 自动加液器：5-25mL。
7.2.4 试管搅拌器
7.2.5 旋转搅拌器
7.2.6 旋转蒸发器：配备真空泵。
7.2.7 水浴
7.2.8 分析天平
7.2.9 冷冻离心机：设定于15℃。
7.2.10 超声波水浴
7.2.11 HPLC装置
泵：Klatos spectroflow 400;UV检测器(278nm)。
积分仪：SP 4290。
色谱柱：Waters 4um C-18 Novapak 柱(150×3.9mm)。
进样器：200μL定量管。
7.2.12 玻璃注射器：250μL。
7.2.13 过滤装置：0.45μm滤膜。

8. 样品和取样程序幕
有关要求见ISO文件78/2-1982 6.3.1节，下列注释引自2052/VI/84EN附录Ⅱ和EEC93/256。
8.1 样品性状：牛奶样品应是能用于残留检测的样品。
8.2 样品量：样品量应满足其它参考方法以及重复测试所需的量。即牛奶样品量不得少于30mL。
8.3 取样后的牛奶需冷冻，并贮存于-20℃以下。

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2008/11/28 7:23:26 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

9. 测定步骤
9.1 将牛奶样品于30℃水浴中解冻。
9.2 均质样品。
9.3 用自动移液器移取5mL均质样品至50mL离心管中。
9.4 加50μL 5mol/L的HCl溶液(6.16)，搅拌10秒。
9.5 用自动加液器(7.2.3)加入25mL乙酸乙酯(6.11)，加硅胶塞。
9.6 将离心管放入旋转搅拌器的板间(7.2.5)，使旋转轴与板垂真，以40rpm搅拌10min。.
9.7 离心（在2400g下）5min。
9.8 用25mL玻璃移液管(7.1.1) 移取20mL有机相至25mL或50mL圆底烧瓶(7.1.4 )中。
9.9 于30℃中，用旋转蒸发器蒸发至干。
9.10 用自动加液器(7.2.2)加入1.6mL正己烷-氯仿(1+1)混合液溶解油状残渣物。
9.11 高速搅拌15秒(7.2.4)。
9.12 用自动加液器加入0.8mL水。
9.13 加聚乙烯塞，用旋转搅拌器(7.2.5)以35rpm下搅拌5min，将烧瓶水平放置，使轴与旋转板平行。
9.14 将烧瓶的容物转入溶血管中，并加塞(7.1.6)。
9.15 离心（在3300g下）10min。
9.16 用注射器(7.2.12)吸取250μL清液，色谱分析。
9.17 添加回收样品
9.17.1 用自动加液器分别各移取4.9mL牛奶控制样品于5个离心管(7.1.2)中。
9.17.2 分别移取0.1mL 100，250，1250和250mg/ml浓度的标准工作溶液至上述离心管中，添加水平分别为2，5，10，25和50ng/mL。
9.17.3 搅拌混均，放置15min。
9.17.4 以下按提取步骤9.4－9.16进行。
9.18 HPLC
9.18.1 流动相：0.005mol/L(NH4)2HPO4- 乙腈(82+18)。
9.18.2 流量：1mL/min。
9.18.3 波长：278nm。
9.18.4 氯霉素的保留时间约10min。

10. 结果计算
10.1 将浓度为10，25，50，125，250μg/mL标准工作溶液（相当于牛奶中含2，5，10，25，50ng/mL进行色谱分析，绘制校正曲线，检查线性范围。
10.2 依据添加回收样品(见9.17)而计算回收率。在浓度2-50ng/mL中，其平均回收率为93.2±4.7%。
10.3 采用校正曲线法，按下式计算样品中测得的氯霉素含量，同时应考虑其回收率和稀释倍数。

A×Ce×0.8×25 A×Ce
C = —————————— = ——————
Ae×5×20 Ae×5

式中： A —— 样品中氯霉素的面积或峰高；
Ae —— 标准工作溶液中氯霉素的面积或峰高；
Ce ——标准工作溶液的浓度。

10.4 测定空白
在检测低限色谱条件下，牛奶样品基体应在氯霉素保留时间处无干扰。
10.5 准确度
准确度是依据UHT牛奶中添加样品的测试，其中添加水平分别为2，5，10，25，50ng/mL，每个添加浓度水平测定4次，结果见表1。

表1 方法的准确度
测得值
（ng/mL）添加浓度
（ng/mL）标准偏差
（ng/mL）变异系数
（％）回收率
（％）
2.01
4.62
9.35
22.71
44.45 2
5
10
25
50 0.09
0.21
0.08
0.05
0.55 4.46
4.42
0.82
0.24
1.23 100.3
92.5
93.6
90.9
88.9

10.6 定性和定量检测限
10.6.1 定性检测限由30个全脂或半脱脂UHT牛样品奶确定，即等于控制样品测得的平均值再加上3倍的平均标准偏差。
限量值为CNEVA实验0.292＋(3×0.136)＝0.7ng/mL。
10.6.2 定量检测限由10.6.1样品确定，即等于控制样品测得的平均值再加上10倍的标准偏差。
限量值为1.66ng/mL。
10.7 线性范围
从10.1样品分析得出，线性回归方程为为Y＝0.885X＋0.335，γ=0.9998。
10.8 精密度
精密度数据是依据CNEVA实验研究得到，即三位操作者，（5，10，25，50ng/mL）4个浓度水平测试(因有些实验室的检测器难以到2ng/mL的检测水平值)，每位操作者对每一水平测定四次，其重复性和精密度水平按ISO标准5725(1986)计算，结果见表2。
表2 方法的精密度
样品序号
（ng/mL）添加水平
（ng/mL）测得值
（ng/mL）测得范围
（ng/mL）重现性重复性
Sr CVr(%) r SR CVR(%) R
1
2
3
4 5
10
25
50 4.83
8.89
23.50
44.34 4.50-5.11
8.35-9.43
22.05-24.80
42.08-46.13 0.089
0.281
0.337
1.151 1.86
3.16
1.44
2.60 0.054
0.794
0.959
3.258 0.228
0.397
1.078
1.169 4.71
4.46
4.59
2.64 0.645
1.123
3.051
3.309

对于每个浓度水平，重现性中的SD以Sr表示, CV以CVr表示，重现性以r表示。对重复性中的SD以SR表示,CV以CVR表示，重复性以R表示。
R和r值应小于单次测定结果（置信度为95%时）的R和r值。
注意：CVr范围为1.44%-3.16%，低于限值(在10ng/g时)为15%。其CVs的评判标准见文件第5节。

11. 特殊事例

12. 方法注意点
荧光斑点在日光下不稳定

13.质量控制
应注意大多数工作溶液仅适用于合法目的。

14. 检测报告

15. 缩写语(略)
见手册中12节附录1中缩写。

16.检验流程图
牛奶 →溶剂萃取(乙酸乙酯) →萃取(三氯甲烷/已烷) →用水萃取 →HPLC测定

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