气相色谱一质谱法确证测定肉、牛奶、蛋和尿中的氯霉素(EEC,确证法)Chloramphenicol-Confirmation of Chloramphenicol in Meat, Milk, Eggs and Vrine by Gas Chromatography-Mass Spectrametry
(EEC Cy3.5 Confirming Method)
引言
氯霉素(CAP)是一种具有广谱性的抗生素,作为药物常用于家畜疾病治疗和预防。一些国家禁止在蛋鸡和奶牛上使用CAP。许多国家在肉制品中规定它的MRL为0-10 g/kg。
1. 应用范围
欧盟(EEC)对氯霉素制定了限制使用的规定。为了确保蛋鸡和乳牛饲养场不再使用氯霉素,为了对动物源肉品中氯霉素残留量进行监控,同时为了对饲养场和屠宰厂抽取的样品进行筛选即检测是否有这种药物残留,一旦经其它许多方法筛选呈阳性,必须用该法进一步检验确证。这项工作的贯彻完全符合欧盟有关的残留物指令(86/469/EEC)。
2. 应用范围
本法是用来确证测定肉、蛋和尿中氯霉素残留物,也适用于牛奶样品,本法检测限为0.1 g/L或0.1 g/kg。
3. 参考文献。
Commission Decision, 93/256/EEC, Laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action [OJ. No L.118, 14.4. 93. pp 64-74]
2052/VI/84 File 6.11 II-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group-“Reference Methods for Residues”, General Criteria for the establishment of Reference Methods for the Detection of Residues.
ISO standard 78/2-1982 Layout for standards-Part 2: Standard for Chemical Analysis.
Development and validction of a gas chromatographic spectrometric procedure for the quantitation and identification of residues of chloramphenical. Van Ginkel, L. A., Van Rossum, H.J. zoontjes P.W., Van Blitterswijk, H. Ellen, G., van Heeft, E., de Jong , A.P.J-M., and zomer, G.(1990), Anal, chim, Acta. 237., 61-69.
Eine Radioimmunlogische Bestimmung Von chloramphenicol-Riickstanden in Muskurlatur, Milch und Eiern. Aruold. D., Berg, D.Van, Biertz, A.K., Mallick, U and Somogyi, A (1984), Arch. Lebensmittelgyg. 35, 131-136.
Reference standards for residue analysis of chloramphenicol in meat and milk: A critical study. Balizs, G. and Aruold, D. (1989), Chromatographia, 27, 489-493.
Trace analysis of chloramphenicol residues in Eggs, Milk and Meat: Comparison of gas Chromatography and radioimmunoassay. Arnold, D. and Somogyi, A. (1985). J. A. O. A. C., 68 984-990
EEC Document: 2406/VI/85-EN File 6.21 II-4 “Draft Relerence Method for the detection of residues of chloramphenicol in meat”.
4. 定义
氯霉素含量是指按本法测得的被测物质中氯霉素的量,不考虑其化合物的形式。含量以mg/kg或 g/L表示。
5. 方法提要
本法包括六个步骤:
尿: (1) 尿样水解
(2) Extrelut柱提取
(3) Sep-pak C18小柱净化
肌肉和蛋: (1) 均质
(2) 萃取至乙酸乙酯中(EtAc)
(3) HPLC净化
(5) 衍生
(6) 色- 质联用(GC/MS)分析
注意:(6) 氯霉素可用质谱仪在(EI)或(ECNICI)模式分析,按照ECNICI测定,其检测录敏度可增加5-10倍。
牛奶样经适当脱脂后,可按尿样方法提取。
6. 材料
6.1 化学试剂
6.1.1 基准物质(标准样品)
标准化合物
氯霉素。Cas NO.56-75-7; C11H12Cl2N2O5, M = 323.1
(Boehringer- Mannheim, NL, Art No. 634433)
6.1.2 内标37Cl2-氦霉素,由RIVM合成
6.1.3 乙醇
6.1.4 甲醇
6.1.5 异辛烷
6.1.6 乙腈
6.1.7 二氯甲烷
6.1.8 盐酸
6.1.9 乙酸乙酯
6.1.10 醋酸
6.1.11 醋酸钠
6.1.12 硫酸钠
6.1.13 ExtrelutR (Merck, art. No. 11737填料art. no. 11738)
6.1.14 醋酸缓冲液,2.0mol/L, PHS.2
将25.2克醋酸(6.1.10) 溶解于600mL水中,加129.5克醋酸钠(6.1.11).调节pH至5.2±0.1, 最后定容至1000mL。
6.1.15 HPLC洗脱缓冲液,乙醇/异辛烷(3:97,V/V)。
6.1.16 磷酸二氢钠
6.1.17 磷酸二氢钾
6.1.18 固相萃取混合溶液
6.1.18.1 甲醇/水(10:90,V/V),混合10mL甲醇和90mL水。
6.1.18.2 甲醇/水(45:55,V/V),混合45mL甲醇和55 mL水。
6.1.18.3 乙腈/水(20:80,V/V),混合20 mL乙晴和80mL水。
6.1.19 内标贮备液,含量1g/L于乙醇中,在-20℃下保存。
6.1.20 内标工作液,含量0.01g/L于乙醇中,在+4℃中可保存2周,从贮备液中移取最小体积为0.1mL。
6.1.21 衍生试剂:N,O-613(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)与1%四甲基硅烷TMS (Pierce, art no 398832)。
6.1.22 -葡糖苷酶/硫酸酯酶 (Brunschwig Chemie, Amsterdarn, Nl).
6.1.23 固相萃取柱(Sep-Pak ,C18) (Waters-Millipore, art. No 51910)
6.1.24 固相萃取柱(Sep-Pak, Silica) (Wators-Millipore, art. No 51900)
7. 仪器设备
7.1 玻璃圆底烧瓶:150mL。
7.2 玻璃巴氏细移液管。
7.3 自动移液器。
7.4 冷冻离心机。
7.5 台式离心机。
7.6 玻璃离心管: (55mm×11.5mm)。
7.7 电热水浴锅,温可调至50±2°C和37°C±2°C并配有氮装置。
7.8 涡旋混合器。
7.9 HPLC系统。
7.9.1 标准恒流HPLC仪,用于萃取液净化。
7.9.1.1 HPLC泵,600A型(Waters/Millipore)或相当者。
7.9.1.2 自动进样系统(Waters/Millipore) 或相当者。
7.9.1.3 固定波长UV检测器(254nm),400型(Waters/Millipore) 或相当者。
7.9.1.4 顶柱Chromguard型(Chrompack 028185) 或相当者。
7.9.1.5 HPLC柱(150mm×4.6mm)内填Lichrosorb Diol微珠(Merck) 或相当者。
7.10 玻璃衍生瓶:具螺旋盖。
7.11 培养箱。
7.12 具有吹氮装置的专用加热器具(Pierce no. 19=8790),用于对衍生瓶的加热。
7.13 玻璃进样瓶。
7.14 铝盖。
7.15 气-质联用仪,带EI电离源。
7.15.1
气相色谱仪。
7.15.2 自动进样器。
7.15.3 质量选择检测器(MSD) (HP 5970) 或相当者。
7.15.4 化学工作站(HP 59970)。
7.15.5 打印机。
7.15.6
气相色谱柱,SE-52石英毛细管柱,25m×0.25mm ID,膜厚0.25 m ( Machery-Nagel, art no. 723054)。
7.16 GC-MS装置,带化学电离(CI)源。
7.16.1
气相色谱仪(Finningan 9610型,San Jose,CA)或相当者。
7.16.2 质谱仪(Finnigan 4500型,四极质谱) 或相当者。
7.16.3 色谱柱,CP-Sil-19CB石英柱, (25m×4.4mm ID,膜厚0.25 m),(chrompack Middelburg, NL)。
7.17 旋转蒸发器,带40±2℃水浴。
7.18 粉碎机。
7.19 均质机。