主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之二十六）

5.015D． 测定
(a) 玻璃器皿准备：玻璃器皿应先用洗涤剂或重铬酸溶液洗涤，去除污染物，接着用水冲洗除去洗涤剂，再用甲醇润洗。
(b) 样品制备
(1) 尽可能在最清洁的条件下，采集动物新鲜的肉、肝、肾和胃。
(2) 用绞肉机绞碎新鲜组织,每份分成100g, 铝箔包好，存放于低温冰箱中。脂肪也应铝箔包好，存放于低温冰箱中。如果直接按步骤7以下操作，样品不必保存。
(3) 称取100g未完全解冻组织至250mL匀质器杯中，加60mL水，匀浆。
(4) 匀浆，45000rpm, 5min。
(5) 匀浆液移入1L广口冷冻干燥烧瓶中，10-20mL水淋洗。
(6) 将烧杯水平放置于干冰-丙酮浴中,转动烧瓶。混合物冷却后呈匀匀冰冻固体层，将其从烧瓶壁中取出。
(7) 将烧瓶置于Virtis冻干机上，冻成干固体，通常需要20-24小时。
(8) 将固体块移至干净纸上，用手扳成碎块，移到提取套筒中。
(3) 肉、肝、肾和肚的提取过程
(1) 将固体样品移至60 180mL Soxhlet提取筒内，压紧,保证完全浸没。
(2) 将取600mL甲醇至提取装置中的1 L烧瓶内，放入提取筒，玻璃漏斗置于提取瓶颈上，并伸到提取筒内。用3 50mL甲醇洗涤1升冷冻干燥烧瓶，洗涤液通过漏斗流入到筒内,装好提取仪上的冷凝管,提取15小时。用电热罩对提取器加热，循环回流一次需18-24min。
(3) 放出提取筒内的甲醇，将提取器和烧瓶内的甲醇混合液放入800mL烧杯内。
(4) 用10mL甲醇清洗烧瓶，并移入至甲醇混合液中，移取50mL 2mol/L HCl沿瓶壁加入到甲醇混合液中，在电热板上煮沸浓缩至125mL。
(4) 脂肪提取过程
(1) 将脂肪切成0.25英寸小方块。因脂肪中水分很少，不必冷冻干燥。
(2) 将100g切好的脂肪放入至60 180mL提取筒内，加750mL甲醇，在Soxhlet提取器上提取15h。用电热罩加热，循环回流一次需18-24min。
(3) 放出提取筒内的甲醇，合并提取器和烧瓶内的甲醇液放入800mL烧杯内。
(4) 用10mL甲醇清洗烧瓶，并移入至合并的甲醇混合液中，将50mL 2mol/L HCl沿烧瓶壁加入到甲醇混合液中，在电热板煮沸浓缩至125mL洗涤烧瓶。
(e) 溶剂分配
(1) 将甲醇浓缩液移入至500mL编号１的分液漏斗中，用70mL氯仿洗涤烧瓶，并移入至漏斗中,混合。
(2) 加300mL水，勿需摇动，让液层分离。
(3) 氯仿层转入编号2的含有100mL 2% NaCl的分液漏斗中。
(4) 水平振摇漏斗30次使溶液分层。为达到最大分层，通常需要20min。
(5) 氯仿层放入至烧杯中。
(6) 分别加3 50mL氯仿, 振摇，以提取漏斗1和2中的内容物。
(7) 合并氯仿提取液，在蒸汽浴浓缩至125mL，冷却至室温。
(8) 将氯仿浓缩液移入至250mL的分液漏斗中，用10mL氯仿润洗。
(9) 用3 20ml 1mol/L 氢氧化钠抽提氯仿，第一次抽提时会出现乳化现象，并且乳化是在氢氧化钠层中。
(10) 来回颠倒分液漏斗，分层。
(11) 每次提取重复混合30次。
(12) 静止分层10min。延长时间有利于乳化消失，提高相分离。在这一步，玉米赤霉醇将从氯仿中转移至上层的氢氧化钠中。
(13) 合并氢氧化钠提取液。
(14) 用3×50mL氯仿(按步骤9操作)洗涤氢氧化钠提取液。静止10min使分层。洗涤氯仿以除去氢氧化钠层中的乳化物和杂质。
(15) 弃去氯仿洗涤液，将氢氧化钠提取液转入至250mL烧杯中，用2 5 mL水洗涤分液漏斗，并移入至氢氧化钠提取液中。漏斗使用后用自来水和蒸水分别洗涤两遍，下次备用。
(16) 用pH计，滴加3mol/L磷酸调节氢氧化钠提取液至pH 8.0。
(17) 将上述溶液移入至250mL分液漏斗中,用10-20mL水润洗烧杯。
(18) 用3×50mL四氯化碳提取溶液，玉米赤霉醇转入至下层的四氯化碳中，每次提取重复混合30次(同步骤11),静置5min,分层。
(19) 合并四氯化碳提取液。
(20) 用2 20mL 1mol/L 氢氧化钠提取四氯化碳混合物。玉米赤霉醇将从四氯化碳转入至上层氢氧化钠液层中。液层混合后，静置5min分层。
(21) 合并氢氧化钠提取液。
(22) 用2×50mL四氯化碳漏斗中提取液,静置5min分层，弃去四氯化碳洗涤液。
(23) 将氢氧化钠提取液转入至250mL烧杯中,用25mL水洗涤分液漏斗,并入至氢氧化钠提取液中,用10 - 20mL水洗涤烧杯，并入至漏斗中（漏斗使用后用自来水和蒸水分别洗涤两遍，下次备用）。滴加3mol/L磷酸调节氢氧化钠提取液至pH 9.5，转入至250mL分液漏斗中，用10-20mL水洗涤烧杯，并入至漏斗中。
(24) 用3 30mL无水乙醚提取pH 9.5水溶液,静置5min分层。玉米赤霉醇转入至上层醚相中。
(25) 合并乙醚提取液至125mL锥形瓶中。
(26) 用蒸汽浴蒸发乙醚,使其体积减至1-2mL。
(27) 将乙醚残留物转入至1打兰瓶中,用1-2mL乙醚沿壁清洗烧瓶,并入瓶中。
(28) 继续蒸发乙醚至0.1mL。
(29) 将瓶子放入真空干燥器中,在室温或接近真空状况下，挥发过夜至干。
(30) 盖上塑料瓶盖,对乙醚残留物进行TMS衍生化制备,气相色谱分析。
(f) 气相色谱
(1) 气相色谱仪操作条件设置如下:
载气压力: 50psi。
载气流速：使玉米赤霉醇衍生物保留时间为4-8min。
电子计范围: 102或101。
检测器温度: 高于柱温10oC以上。
进样口温度: 高于柱温10oC以上。
柱温: 230-270oC,恒温。
记录仪灵敏度: 1mV。
记录仪低速: 1英寸/min。
样品量: 1-5μL, 根据峰面积要求决定进样量。
进样垫：每晚更换，在操作温度下过夜老化。
火焰装置：每周清洗火焰装置上的硅灰，拆开火焰装置，用尼龙刷将电极、火焰喷嘴、烟囱刷干净,用水和丙酮冲洗喷嘴毛细管，除去外来杂质。
(2) 加0.2mL硅化剂至样品和玉米赤霉醇标准品中。
(3) 盖上瓶盖，剧烈振摇。
(4) 在40-50o加温数分钟，然后水平转动，保证瓶内表面全面接触试剂。
(5) 在40oC中静置30min，使反应完全。
(6) 将样品瓶放入有衬垫的小号离心管中，离心。
(7) 将1.0-5.0μL澄清液注入色谱仪中。在每天开始时，用标准品进样3-5次，使色谱柱进入工作状态。
(8) 在分析样品之间，注入超过分析样品浓度范围的已知混合液（在每天的开始、中间、结束），以补偿每日灵敏度的波动和漂移。如果样品只有4个或以下，每日在开始和结束两次校正即可。

5.015E. 结果计算
已知混合标准样和样品的峰面积，可用峰高乘以半峰宽或积分仪测得。已知混合标准样的峰面积对玉米赤霉醇标准品浓度作图，校正曲线表明在0-10μg范围呈线性。根据样品峰面积，在曲线上找出对应的玉米赤霉醇量（μg），控制试验表明：牛肝和牛肉添加回收率为70%。样品计算如下：
样品测得量（μg）× 1000
玉米赤霉醇（μg/kg）= ————————————————
W×R
式中： R —— 按上述步骤测得的校正因子；
W —— 被测组织样品量（g）。

5.015F. 回收率研究
(a) 试剂空白添加试验
(1) 首次使用该方法时，溶剂空白和标准添加试样均按整个流程操作一次。既可得到回收率，又可得到组织测定的结果。无论如何准备工作必须做好，以免溶剂和容器产生污染。同时还要验证加标玉米赤霉醇的回收率。回收率水平应于样品检测范围相同。
(2) 移600mL甲醇至1L烧杯中，加50mL 2mol/L HCl，在电热板上煮沸浓缩至125mL。
(3) 移600mL甲醇至1L烧杯中，加50mL 2mol/L HCl，在电热板上煮沸浓缩至125mL，添加1.0mL储备液D。
(4) 按步骤5.015D(e)，测定上述样品。
(b) 样品添加
(1) 移100g部分解冻组织至250mL均质中，分成两份，其中一份作为组织空白。
(2) 加1mL储备液D至样品中，相当于添加玉米赤霉醇20μg/kg。
(3) 按步骤5.015D(b)3，测定添加和未添加组织样品。

参考文献
联邦规程标准，21节556.760.