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主题：【分享】western bolt

浏览0 回复7 电梯直达

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发表于：2008/12/03 14:11:17 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

非常详细的一个资料,Buffer的配制都写的非常详细,可以做为实验室参考的.

west-blotting 详细

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2008/12/3 19:12:01 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

不是很懂，请教几个问题：
在SDS-PAGE中
1.浓缩胶凝固之后，你上面说的是用水冲洗一下浓缩胶？是不是指的浓缩胶的梳孔？个人感觉是不是用电泳缓冲液冲洗效果是不是好点，用移液器吸取一点缓冲液，洗下梳孔

2.浓缩胶在凝固过程中要补胶，能否详细解释下，不是很清楚？在什么时候补？？

3.上样前，样品要煮沸5min，使蛋白质变性，请问下煮沸之后还用不用再离心了？

谢谢！

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2008/12/4 9:08:43 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dong3626 发表:
不是很懂，请教几个问题：
在SDS-PAGE中
1.浓缩胶凝固之后，你上面说的是用水冲洗一下浓缩胶？是不是指的浓缩胶的梳孔？个人感觉是不是用电泳缓冲液冲洗效果是不是好点，用移液器吸取一点缓冲液，洗下梳孔

2.浓缩胶在凝固过程中要补胶，能否详细解释下，不是很清楚？在什么时候补？？

3.上样前，样品要煮沸5min，使蛋白质变性，请问下煮沸之后还用不用再离心了？

谢谢！

1.嗯,是的洗梳孔.因为胶凝结后会有比较多的残留缓冲液,因此洗一下.呵呵,我一般就用水了,因为电泳缓冲液我是经常重复用,有时候比较脏的了.嘿嘿

2.这个不是特别好操作,有时候分离胶倒多了,浓缩胶比较少,在凝结过程中就慢慢加一点点了.防止梳孔太浅了.

3.我煮沸之后还是会离心一下,短时间意思一下.

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tianru的爸爸

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2008/12/4 11:01:01 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dong3626 发表:
不是很懂，请教几个问题：
在SDS-PAGE中
1.浓缩胶凝固之后，你上面说的是用水冲洗一下浓缩胶？是不是指的浓缩胶的梳孔？个人感觉是不是用电泳缓冲液冲洗效果是不是好点，用移液器吸取一点缓冲液，洗下梳孔

谢谢！

最好是用水，因为一般电泳缓冲液中含有表面活性剂，如SDS，这些在冲洗时产生泡沫，就没有水的冲洗效果好了。

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2008/12/4 12:58:13 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我是指将胶放到电泳缓冲液中之后可以用缓冲液直接冲洗了？
就是用移液器反复的冲洗梳孔几下！

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2008/12/4 15:30:17 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dong3626 发表:
我是指将胶放到电泳缓冲液中之后可以用缓冲液直接冲洗了？
就是用移液器反复的冲洗梳孔几下！

这一步主要是为了除去未凝固的成分，所以一般推荐在拔出梳子之后，用水轻轻冲洗梳孔，之后再将胶放入电泳缓冲液中，进行后续电泳。

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2008/12/4 15:39:46 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dong3626 发表:
不是很懂，请教几个问题：
在SDS-PAGE中
1.浓缩胶凝固之后，你上面说的是用水冲洗一下浓缩胶？是不是指的浓缩胶的梳孔？个人感觉是不是用电泳缓冲液冲洗效果是不是好点，用移液器吸取一点缓冲液，洗下梳孔

2.浓缩胶在凝固过程中要补胶，能否详细解释下，不是很清楚？在什么时候补？？

3.上样前，样品要煮沸5min，使蛋白质变性，请问下煮沸之后还用不用再离心了？

谢谢！

1、理论上我们用水和RUN BUFFER清洗梳孔是一样的，但是在实际运用中我们经常使用的是水，主要原因是基于几点考虑。一是水比缓冲液经济，二是水的清洗效果比缓冲液要好。如果胶的凝固效果非常好，即使省略这一步也是可行的，但对于初学者还是建议规范操作，养成良好的实验习惯。：）
2、浓缩胶在凝固过程中，一般是不建议再补胶的，只有一次成型，才能保证一个好的浓缩和分离效果，保证各个平行样品的可比对性。
3、煮沸5分钟后，严格上是要求再次离心，取上清再上样。

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