主题：【转帖】常见致病微生物的检测

致病性弧菌及检测


一、致病性弧菌的流行病学

1、致病性

　　在众多的弧菌之中，致病性差距很大。O1型霍乱弧菌被WHO定为国际检疫菌，而同时有许多种和生物型根本不具致病性。

生物分类学上的霍乱弧菌有许多血清型致病性很弱、甚至不具致病性。

　　1995年《美国临床微生物手册》第六版明确了弧菌属的致病菌为12种，它们的名称及致病情况如下表所示：

表1. 致病性弧菌及所致疾病


弧菌种类                        临床表现
             胃肠炎      创伤感染  耳感染        败血症
O1型霍乱弧菌      +++
O139型霍乱弧菌  +++ 　　　　++　　　　　　 +　　　　　+
拟态弧菌      ++ 　　　　　　　　　　　　+
河弧菌      +
副溶血性菌    +++　　　　　　　　　　　　　　　　　　　+
霍利斯性菌++ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　  　  +
溶藻弧菌（+） 　　　++　　　　　　    ++　　　　　    +
弗尼斯菌（+） 　　　++ 　　　　　　　　　　　　　      ++
创伤弧菌（+） 　　　++　　　　　　　　　　　　　      ++
麦契尼可夫弧菌（+）
海鱼弧菌          　++　　　　　　　　　　　　　      +
辛辛那提菌                                            　+
鲨鱼弧菌      　　+

注：+++：常见；++：不常见；+：罕见；带括号者为肠道感染的病因作用尚未确定。

　　12种致病性弧菌的致病性差别较大，所致疾病的种类和毒性差别较大。在这12种致病菌中，最重要的，也是出问题最多的
是O1型霍乱弧菌、非O1型霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌。国内外均是如此。美国FDA在“食品微生物控制”中特别强调了这
四种菌，欧洲的NMKL也对这四种菌提出了特别要求，并有专门方法NMKL No.156颁布。

2、美国FDA对霍乱、副弧、创伤弧菌的认识（见表2）

3、致病性弧菌的控制

　　弧菌和其它G-菌一样，是嗜温型菌，生长需较高的温度，高水活度，中性pH。与其它不一样的是，生长需要盐，故而十分耐盐，
但轻微热处理很易将其杀灭。

　　蒸煮控制，防止二次污染，防止时间/温度控制不当（注意冷藏），控制产品来源。

二、致病性弧菌的分类学位置和生物学性状

1、致病性弧菌的分类

　　根据伯杰氏细菌手册第九版的描述，12种致病性弧菌的分类学位置如下表所示：

第5部分 革兰氏阴性兼性厌氧杆菌

弧菌科

弧菌属

致病性弧菌

　　伯杰氏细菌手册将细菌分为35部分（Group），第5部分为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，包括弧菌科、肠杆菌科、巴斯德氏菌科、
其他属，弧菌科包括弧菌属、发光杆菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属和Enhydrobacter属。

　　弧菌属共有37个种（变种），其中已明确有12个种对人类有致病作用。弧菌属的种除了霍乱弧菌和拟态弧菌之外均为海洋性细菌，
即有嗜盐性；即使是这两种菌， Nacl的存在也能促进生长。

2、致病性弧菌的生物学性状

（1）致病性弧菌的基本特征

　　根据分类学位置，致病性弧菌首先属于弧菌科，所以具备弧菌科的所有特性：革兰氏阴性、兼性厌氧，（弧）杆状。

　　作为弧菌属，可从下列特性与弧菌科的其他四个属区别开来：DNA、G+C、 MOL%:38-51、O/129敏感：+、脂酶：+、 D-甘露醇
发酵：+、端生存鞘鞭毛+（其它没有）

（2）致病性弧菌生理生化特性比较

三、致病性弧菌的检测方法

1、具有代表性检验方法简介

（1）、FDA的细菌学分析手册

　　霍乱、付弧、创伤弧菌和其他弧菌（1995 1998修订）分别着重介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌的方法。

　　用PCR方法检测产肠毒素的霍乱弧菌叙述了霍乱肠毒素（cholera Toxin (T)基因

（2）、AOAC官方分析方法

　　牡蛎中的霍乱弧菌：升温富集法（1995.a）

　　创伤弧菌的脂肪酸气相色谱鉴定法（AOAC.1995.b）

　　美国midi公司生产的shelock微生物鉴定系统。

（3）、ISO方法

　　副溶血弧菌的检测方法（ISO8914：1990E）

（4）、NMKL

　　食品中致病性弧菌的检测和计数（NMKL N0156）介绍了霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的检测程序。

（5）、不同国家的方法

　　日本、瑞士等国均有相应检验方法。

2、致病性弧菌的检测方法

　　以上介绍的方法均是以单一或少数目标菌（NMKL为四种）为目的的设计的程序。鉴于国外对出口食品中多种致病性弧菌的要求和重视，
有必要探讨“同一程序同时检测多种弧菌”方法。

检验程序

　　25g样品+225mL APW(1% NacL pH9.0)

增菌 ↓37℃8-16h

取10mL加入双倍APW

↓37℃6-8h

选择 选择培养基 TCBS

（霍利斯用非选择性的羊血球琼脂）

↓37℃24h

定弧菌 取黄色或绿色菌落做G染色、氧化酶、动力、

↓ O/129(150ug)、D-甘露糖

分组 初步鉴定：0% NacL , 1% NacL、硝酸盐还原、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧、鸟氨酸脱羧、 （氧化酶）
分成5组

↓

确证 最后鉴定

单核细胞增生李斯特氏菌及检验


　　单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必须加以重视。

一、生物学特性

1、形态与染色

　　该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm,直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

2、培养特性

　　该菌营养要求不高，在20--25℃培养有动力，穿刺培养2�5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2--42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8�4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)和改良Mc Bride(MMA)琼脂上，用450角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

3、生化反应

　　该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

4、血清型

　　根据菌体（O）抗原和鞭毛(H)抗原，将单增李氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。

5、抵抗力

　　该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

二、流行病学

　　单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率为0.6-16%,有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

　　该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

三、致病性

　　单增李氏菌进入人体后是否发病，与菌的毒力和宿主的年龄、免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，易感者为新生儿、孕妇及40岁以上的成人，此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

　　单增李氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：

1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；

2、抗活化的巨噬细胞，单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；

3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，为SH�活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。

四、检验和控制

（一）检验

1、增菌培养

　　取回的样品应在4℃下处理、存放和运送，如果是冷冻样品，则在检验前要保持冷冻状态。

　　取25mL液体或25g半固体或固体样品放入含有225mL无选择性试剂增菌肉汤（EB）的均质杯中进行均质，然后转入三角瓶中，30℃培养4h，加入选择性试剂吖啶黄素、萘啶酮酸和放线菌酮，继续培养20h和44h.。

2、分离

　　共培养24h和48h后，取EB培养物分别在OXA和LPM或加七叶苷/Fe3+LPM琼脂平板上划线。PALCAM琼脂可替代LPM琼脂。将OXA和PALCAM平板置于35℃培养24-48h，LPM平板在30℃培养24-48h。然后，把LPM平板放于解剖镜载物台上，以450角入射光从平板下面照射平板，通过目镜垂直向下观察寻找可疑菌落。李斯特氏菌在LPM平板上呈有光泽的兰色或灰色。用已知阳性菌和阴性菌划线的平板作对照。

　　加入七叶苷和Fe3+的LPM平板不用斜射光系统，选择可疑菌落的方法与在OXA上选择可疑菌落的方法相同。在OXA平板上李斯特氏菌菌落周围有一个黑色环，其它菌也可形成黑色环，但形成时间要在两天以上。李斯特氏菌在PALCAM和OXA平板上的菌落特征相似。

　　在PALCAM和OXA或LPM平板上挑取5个或更多的典型菌落，分别划线于TSAYE平板上以得到更纯、更典型的单个菌落。食品检验中在TSAYE平板上纯化是必须的，因为在PALCAM和OXA或LPM平板上分离菌落时可能沾有不可见的受抑微生物。挑取5个典型菌落的原因是一个样品中可能分离到一种以上的李斯特氏菌。30℃TSAYE平板培养24-48h，如果不用于动力观察，也可在35℃培养。

3、鉴定步骤

　　（1）观察TSAYE平板通过斜射光观察，寻找呈兰灰至兰色菌落。在TSAYE上用已知菌作对照。

　　（2）、从30℃或更低温度下培养的TSAYE平板上挑取典型菌落做成湿玻片在油镜下观察。湿玻片用0.85%生理盐水菌悬液制成。如果菌量太少，菌体黏附于载玻片上而呈现非运动性。李斯特氏菌是细短杆菌，可见轻微的旋转及翻滚。与已知的李斯特氏菌的对照相比，球形、大的杆状且快速泳动的都不是李斯特氏菌。

　　（3）挑取典型菌落进行过氧化氢酶实验，李斯特氏菌呈过氧化氢酶阳性反应。

　　（4）取16-24h的培养物进行革兰氏染色，李斯特氏菌呈革兰氏阳性杆菌。但是陈旧培养物革兰氏染色会发生变化，而且菌体可成球形。在染色过重的玻片上菌体有呈栅状排列的趋势，易误认为白喉菌而错判。

　　（5）挑取典型菌落接种于TSBYE肉汤管中，35℃培养24h用做糖类发酵和其它生化项目实验。TSBYE肉汤管在4℃下可存放几天，也可反复接种。

　　（6）在TSAYE平板上挑取典型菌落刺种到5%的绵羊血或马血琼脂平板上，刺种时避免触到平板底部和使琼脂破裂，同时设阳性对照（单核细胞增生李斯特氏菌和绵羊李斯特氏菌）和阴性对照（英诺克李斯特氏菌），35℃培养48h。单核细胞增生李斯特氏菌呈窄小的β-溶血环。

　　（7）在明亮的光照下，观察经穿刺的血琼脂平板，单核细胞增生李斯特氏菌和西尔李斯特氏菌围绕穿刺点产生较清晰的β-溶血环，英诺克李斯特氏菌不产生溶血现象，而绵羊李斯特氏菌产生界限明显的较大溶血环，在此不要试图进行种间的区分，但要记录下溶血反应的特征，CAMP试验可区分它们间的溶血反应。

　　（8）硝酸盐还原试验（选做）。用TSBYE肉汤培养物接种于硝酸盐肉汤中，35℃培养5天后，加入0.2mL试剂A，再加入0.2mL试剂B，混合，出现紫红色为阳性反应，表明硝酸盐已被还原，如无颜色出现，在试管内再加入少量锌粉，放置1h，如出现紫红色，表明硝酸盐仍存在，未被细菌还原。只有默氏李斯特氏菌还原硝酸盐，因此，从格氏李斯特氏菌中区分出默氏李斯特氏菌就必须进行这唯一的试验。本试验还有一等效试验，即加入0.2mL试剂A后，再加入0.2mL试剂C，出现橙色表明硝酸盐已被还原。如未出现颜色反应，也加入少量锌粉，若出现橙色表明硝酸盐未被还原。

　　（9）将TSBYE培养物穿刺到SIM和MTM试管中，室温培养7天，每日观察，李斯特氏菌呈典型伞状生长。在MTM中伞状生长更典型。同时，30℃的TSBYE培养物在油镜下可见细菌作翻转运动。

　　（10）将TSAYE肉汤培养物分别接种于0.5%（W/V）葡萄糖、麦芽糖、七叶苷、甘露醇、鼠李糖、木糖发酵管内（可选用倒立发酵管），35℃培养7天，呈阳性反应的李斯特氏菌产酸不产气，李斯特氏菌发酵鼠李糖和木糖的情况见下表。所有李斯特氏菌对葡萄糖、七叶苷、麦芽糖均能发酵，除格氏李斯特氏菌均不能发酵甘露醇。如果在OXA、PALCAM或加七叶苷/Fe3+的LPM分离平板上菌落色素很明显，则七叶苷试验可免做。

将TSBYE肉汤培养物接种到3mLTSBYE肉汤中，35℃培养24h，接种2支TSAYE琼脂斜面，35℃培养24h。用3mL0.01mol/l磷酸盐缓冲液将斜面菌苔洗下，菌悬液于80℃水浴中加热1h，以2500r/min离心30，弃去2mL上清夜，将剩余液与沉淀混匀制成菌悬液，进行血清学玻片凝集试验。

5、小鼠毒力试验

　　将分离的菌株接种到10 mL TSBYE肉汤中，35℃培养24h，将培养物离心、浓缩，用1mL生理盐水制成菌悬液（浓度为1010个菌/mL），取0.1mL腹腔注射体重为16-18g 小鼠，每组5个观察7d内小鼠死亡情况。用已知致病的单增李斯特氏菌和非致病的英诺克李斯特氏菌相同方法进行，做对照试验。

6、协同溶血（CAMP）试验

　　在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。

（二）控制

　　单增李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2分钟以上。

　　单增李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此蒸煮后防止二次污染是极为重要的。

　　由于单增李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。

弯曲菌属及检验


一、生物学特性
1.形态与染色

　　本菌为革兰氏染色阴性菌,螺旋形,弯曲杆状,大小为(0.2-0.8)μmX(0.5-5)μm，有一个以上螺旋并可长达8μm,也可出现S形或似飞翔的海鸥形，菌体一端或二端有单根鞭毛，长度约为菌体的2-3倍，有活泼的动力或不产生动力，超过48小时的培养物以衰老的球菌状居多。

2.培养特性

　　弯曲杆菌是一类微需氧菌，初次分离时需在含5%氧、85%氮、10%二氧化碳环境中，该菌相对脆弱，对周围环境敏感，如对干燥、加热、消毒、酸性和21%氧气的空气都敏感。培养适宜温度为25-43℃，最适宜温度为42℃。最适pH7.2。对糖类既不发酵也不氧化，呼吸代谢无酸性或中性产物。在布氏肉汤中生长呈均匀混浊。在血琼脂上，初分离出现两种菌落特征：第一型菌落不溶血，灰色，扁平，润湿，有光泽，看上去像水滴，边缘不规则，常沿划线生长；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1mm-2mm），边缘整齐，半透明，有光泽，中心稍浑，呈单个菌落生长。

3.生化特性

　　弯曲菌属各个种的生化特性见表一。

表一 弯曲菌属各个种的生化特性

试验项目
空肠弯曲杆菌
空肠弯曲杆菌多氏亚种
结肠弯曲杆菌
胎儿弯曲菌胎儿亚种
琢豚弯曲杆菌
乌普萨拉弯曲杆菌

25℃生长
－
+/－
－
+
D
0

37℃生长
＋
＋
＋
＋
＋
＋

42℃生长
＋
+/－
＋
D
＋
＋

硝酸盐还原试验
＋
－
＋
＋
＋
＋

3.5%Nacl耐受试验
－
－
－
－
－
－

硫化氢试验（纸条法）
＋
＋
＋
＋
＋
＋

硫化氢试验（TSI）
－
－
D
－
＋
－

过氧化氢酶试验
＋
＋
＋
＋
＋
－

氧化酶
＋
＋
＋
＋
＋
＋

麦康凯琼脂
＋
＋
＋
＋
＋
－

1％甘氨酸生长试验
＋
＋
＋
＋
＋
＋

马尿酸水解试验
＋
＋
－
－
－
－

奈啶酮酸试验
S
S
S
R
R
S

头孢菌新素试验
R
R
R
S
S
S


注：＋：90％以上阳性；D：11－89％阳性；－：90％以上阴性 ；〔－〕：一般不生长。

R为耐受，S为敏感。

二、流行病学

　　空肠弯曲杆菌感染称为弯曲杆菌病，引起腹泻。据报道，从腹泻患者分离出此菌的分离率大大高于沙门氏菌。研究表明，该菌少至500个也可致病，但很少发生死亡，死亡率为千分之一。最易感人群是5岁以下儿童和15－29岁的青年。该菌广泛存在于鸟、禽、猫、狗等动物体内，从牛奶、蟹肉、河水和无症状人群粪便中可分离到此菌。健康的鸡和奶牛携带该菌。弯曲杆菌已涉及生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿、未经氯处理的水。

　　本菌抵抗力不强，易为干燥、直射阳光及弱消毒剂等杀灭，58℃5分钟可杀死。对青霉素、头孢霉素耐受，对红霉素、四环素、庆大霉素敏感。

三、致病性

　　弯曲杆菌在胆管中生长，小肠上端微需氧环境适宜本菌生存和繁殖，造成空肠、回肠和大肠组织损伤，通过肠粘膜侵入血液。空肠弯曲菌感染的患者，临床表现发热、腹泻、呕吐和肌肉痛。潜伏期平均3－5天，病程7－10天。1－2天后，粪便的特征是带血，镜检中有多形核白血球，重症病例也有痢疾样血、粘液便，常误诊为急性溃疡性肠炎。该菌感染自然恢复，抗生素能进一步限制感染病人粪便中细菌的存活时间。

四、检验

1.增菌：

A、碎牛肉

　　称取25g样品,置于匀质杯中,加入100mL增菌肉汤.用匀质器以8000-10000r/min匀质30s。将匀质液通过灭菌纱布,倒入250mL三角瓶中,于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

B、净膛全禽和分割肉

　　在一个灭菌容器中,用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min.肉汤经灭菌纱布过滤,于23000xg、4℃离心20min,或于16300xg、4℃离心30min,弃去上清液,将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

C、牛奶

　　称取40g牛奶放入离心管中,按2.条中方法离心.弃去脂肪和上清液将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入100mL增菌肉汤,摇匀。于微需氧条件下,35℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

D、贝类

　　将100g样品和100mL增菌肉汤放入均质杯中,用均质器以8000-10000r/min均质30s。用灭菌纱布过滤,取滤液50mL滤液放入500mL三角瓶中,加入200mL增菌肉汤, 于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养20-44h。

E、河水或污水

　　取水样2-4升,每升水样加入5mL1M硫代硫酸钠,用0.45μm微孔滤膜过滤,立即将滤膜置

　　于100mL增菌肉汤中, 于微氧条件下,30℃预增菌3h后,再于37℃增菌2h,然后于42℃培养20-44h。

2.分离和初步鉴定

　　取5mL经20-44h增菌的培养物,以0.65μm孔径滤膜过滤.取经过滤和未经过滤的增菌培养物,分别在分离用琼脂平板上划线接种,各不少于二个平板.将平皿置于微需氧条件下42℃培养24-48h。检查平板上有无透明-白色-棕黄色(可能出现浅红色)凸起、边缘不整齐、有时沿接种线向外扩散的菌落.挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野)显微镜检查,本菌呈快速螺旋运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性,如小逗点状,两菌体的末端相连时,呈S形、海鸥形或螺旋状.挑取初步鉴定为弯曲杆菌的菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上。根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。

3.证实试验

　　从用作纯分离的平板挑选二个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于50mL三角瓶中的4mL布氏肉汤中,于微需氧条件下42℃培养24-48h.同时接种一份阳性培养物作为对照。通常用于生长试验和生化反应的基础培养物是含0.18%琼脂的布氏肉汤。该培养基分装于试管中,每管7mL。从所有布氏肉汤中取出接种物,滴加0.2-0.3mL于琼脂表面。

(1).生长温度试验

　　接种3管含0.002%中性红(NR)的基础培养基,其中一管置于37℃培养,检查在这一温度下的生长情况,并用于观察过氧化氢酶反应。另二管分别置于25和42℃培养。每日检查有无生长。对未生长者,需培养5d方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长仅限于接近培养基表面的一薄层,广泛的生长不是弯曲杆菌属细菌所致。

(2).过氧化氢酶试验

　　滴加3%过氧化氢溶液于有细菌生长的试管中,产生气泡者为阳性反应。

(3).氧化酶试验

　　使用琼脂平板表面经24h培养的生长物.将氧化酶试剂滴于棉拭子上,用棉拭子接触生长物表面,接触点变为深蓝色者为阳性。

(4).硝酸盐还原试验

　　将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基中,置空气中于37℃培养5d.加入亚硝酸盐检测试剂,出现红色者为阳性反应。

(5).1%甘氨酸中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和1%甘氨酸的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(6).3.5%氯化钠中生长试验

　　将供试培养物接种于加有NR和3.5%氯化钠的基础培养基。置空气中于37℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5d,方可作出最后判断。

(7).硫化氢产生试验

　　将肉汤培养物接种于加有0.02%盐酸半胱氨酸的基础培养基,将一根浸有饱和乙酸铅的滤纸条悬于试管的上部(不让滤纸条接触培养基),旋紧试管帽。 置空气中于37℃培养.每日检查，观察滤纸条是否变黑，变黑表明有硫化氢产生，为阳性反应。对未出现阳性反应者需培养5d,方可作出最后判断。

（8）.TSI试验

　　接种于TSI斜面，于微需氧条件35－37℃培养5d.空肠弯曲菌不产生硫化氢。所有弯曲杆菌属为碱性/碱性反应。

(9).麦康凯试验

　　将供试培养物接种于麦康凯培养基,于微需氧条件37℃培养3d,记录有无生长。

(10).马尿酸盐水解试验

　　用试管分装马尿酸盐水解培养基,每管0.4mL,冻存备用。将琼脂平板上培养过夜的生长物接种于1%马尿酸溶液中,振摇后置37℃水浴中放置2h。每管加入0.5mL茚三酮试剂(将3.5g茚三酮溶于100mL1:1丙酮和丁醇中),室温下放置2h,出现紫色者为阳性反应。

(11).抗生素敏感性试验

　　用灭菌棉拭子将预先准备好的布氏肉汤培养物涂布于布氏琼脂平板。将头孢菌新素(30μg)和奈啶酮酸(30μg)的圆纸片分别贴于平板表面。于微需氧条件37℃培养24h,检查有无抑菌圈。

　　根据生化鉴定结果表对细菌作出鉴定。


附: 抗生素溶液

　　头孢哌酮钠（Sodium cefoperazone）:称取0.5g,用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存5天。

　　三甲氧卞氨嘧啶乳酸盐:称取0.66g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存1年。

　　万古霉素: 称取0.5g, 用水溶解后,定容于100mL容量瓶中。经0.22μm滤膜过滤。该溶液4℃保存2个月。

　　放线菌酮: :称取1.25g, 用乙醇溶解后,用水定容于100mL容量瓶中。该溶液4℃保存1年。

　　每1000mL经灭菌的布氏增菌肉汤中加入以上4种溶液各4 mL。

产气荚膜梭菌及检验


一、流行病学
　　产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。可引起典型的食物中毒、爆发。由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。摄食被本菌污染的食品后8�22小时开始发病。在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1�2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。

　　据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。

　　产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。

　　产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽胞能耐受100℃,1�5小时的加热。除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。

　　当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞，由于蒸煮而使其可能发芽。蒸煮后需要经过快速一致的冷却。事实上在所有暴发的病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当做好的食品量又是很大时，适当的热处理（60℃以上）充分的再加热，冷却食品（最低中心温度为24℃）也是必要的控制措施，培训食品加工人员，仍是控制措施的一个关键方面。

二、生物学特性：

1、形态：

　　本菌菌体两端钝圆，直杆状1-2×2-10μm，革兰氏阳性，卵圆形芽胞位于菌体中央或近端，不比菌体明显膨大，但有些菌株在一般的培养条件下很难形成芽胞，无鞭毛，在人和动物活体组织内或在含血清的培养基内生长时有可能形成荚膜。

2、培养：

　　本菌虽属厌氧性细菌，但对厌氧程度的要求并不太严，甚至在EH=200-250mv的环境内也能生长。

　　在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。生长适宜温度为37-47℃，多认为43-47℃为最宜本菌生长和繁殖速度极快，在适宜条件下增代时间仅8min，可利用高温快速培养法，对本菌进行选择分离，如在45℃下，每培养3-4小时传种1次，即可较易获得纯培养，在深层葡萄糖琼脂中大量产气，致使琼脂破碎，在牛奶培养基中，可见到暴裂发酵，在庖肉培养基中培养数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色，但不被消化。

　　在普通琼脂平板上培养15小时左右可见到菌落，培养24小时菌落直径2�4mm，呈凸面状，表面光滑半透明，正圆形，在营养成分不足或琼脂浓度高的平板上，有时尤其经过传种的菌株，可能形成锯齿状边缘或带放射状条纹的R型菌落。

　　在含人血、兔血或绵羊血的琼脂平板上培养的菌落周围有双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状。

　　在乳糖、牛奶、卵黄琼脂平板上培养的菌落周围出现乳光浑浊带。此反应能被本菌α抗毒素抑制。由于发酵乳糖菌落周围的培养基颜色发生变化（中性红指示剂呈粉红色）不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层。

3、生化特性：

　　所有菌株均发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，液化明胶，不产生靛基质，还原硝酸盐为亚硝酸盐，但也有例外。能将亚硫酸盐还原为硫化物。在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落。发酵牛奶中的乳糖、牛奶酸凝固，同时由于大量产气凝块碎裂，所谓暴力发酵，这是本菌的主要生化特征之一，也是主要鉴别的指标。G+C克分子百分比为24-27%。

　　产生卵磷脂酶（磷酸酶C）分解卵磷脂为磷酰胆碱与非水溶性甘油二酸酯，上述卵黄琼脂平板菌落周围出现的乳光浑浊带即属本反应。

4、毒素:

　　(1)、外毒素:各型产气荚膜梭菌产生的外毒素(或可溶血抗原)共有12种,其中主要有4型,即A、B、C、D.而已知〝A型〞毒素与人类食物中毒有关。

　　(2)、肠毒素:A型产气荚膜梭菌的耐热株能引起人的食物中毒,关于产气荚膜梭菌食物中毒的发病机制,基本认为是,被耐热性A型产气荚膜梭菌芽胞污染的肉、禽等生食品,虽经烹制加热,但芽胞不仅不死灭,反而由于受到〝热刺激〞,在较高温度长时间储存(即缓时冷却)的过程中芽胞发芽,生长,繁殖,而且随食物进入人肠道的这些繁殖体容易再形成芽胞,同时产生肠毒素,聚集于芽胞内,当菌体细胞自溶和芽胞游离时，肠毒素将被释放出来,人、猴、狗等口服人工提取的该肠毒素能引起腹泻。

　　人和动物对产气荚膜梭菌的毒素的免疫主要表现为抗肠毒素的产生,健康者血清常含有抗肠毒素,似乎表明产气荚膜梭菌作为正常菌群,在肠道内可能在不断地产生着肠毒素。

三、检验方法:

1、样品的储存和运送:

　　如样品不能立即进行检验时,应在样品中加等量缓冲甘油--氯化钠溶液(液体食品应加双料的),将样品做低温保存,直到检验,运送样品时,应使样品保持冷冻状态,并要避免容器消损。

2、将解冻样品取25g移入灭菌的均质杯,并加入0.1%蛋白胨水225mL,低速搅拌1-2分钟,使之均质化,作为1:10稀释液,以上1:10稀释的均质液,按1mL加入0.1%蛋白胨水9mL,作做成10-2--10-6的系列稀释液,(如为液体样品则可吸取25mL加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释并摇匀,再作10倍递增稀释即可)。

　　倾注不含卵黄的TSC琼脂倒10个灭菌平皿中,每皿约5mL,并迅速旋转平皿,使琼脂凝固后,将每个平皿编号标记,以无菌操作,吸取稀释样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心,再向平皿倾注不含卵黄的TSC琼脂15mL,缓慢地旋转平皿,使其与接种物混合均匀.也可用灭菌L棒,将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于不含卵黄乳液的TSC琼脂上,将平板水平静置5-10分钟,使接种物被吸收,然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层,琼脂凝固后,将平板置于厌氧罐内于36+1℃,培养20小时,取出平板,用肉眼观察生长情况和有无黑色菌落,挑选有20-200个黑色菌落的平板进行记数，产气荚膜梭菌的菌落一般呈黑色。

3、证实:

　　从可记数的平板(具20-200个菌落)中挑选10个典型菌落,分别接种到液体硫乙醇酸钠培养基试管中,于36±1℃,培养18-24小时,取培养物涂片,作革兰氏染色镜检,检查培养物的纯度和细菌形态,产气荚膜梭菌为革兰氏阳性,粗短的梭状芽胞杆菌.对于被污染的培养物可划线接种在含有卵黄的TSC琼脂平板上,于厌氧条件下以36±1℃,24小时培养,以获得纯培养物。

　　上述培养物,以接种针穿刺接种动力,硝酸盐培养基36±1℃厌氧培养24小时观察有无动力,滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL,观察硝酸盐是否被还原,取生长旺盛的硫乙醇酸钠培养液1mL接种含铁牛奶培养基,厌氧培养过夜或46℃2-5小时观察有无暴烈发酵现象,但培养基不变黑,将培养液点种卵黄琼脂平板(每个平板至少可点种10点),倒置厌氧培养装置内36±1℃培养24小时,观察接种点,产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶,分解卵黄中的卵磷脂,使接种点的底部及周围形成乳白色的浑浊带.此外还可作明胶液化及含1%水杨甙和含1%棉子糖的发酵试验等,对上述四项主要生化试验,全部符合者即可确定为产气荚膜梭菌。

4、结果解释及报告:

　　样品中产气荚膜梭菌的计算,基于被证实为产气荚膜梭菌菌落的百分数(例如10‐4稀释的平板中,平均有85个菌落,10个菌落中,有8个被证实为产气荚膜梭菌,那么每1g食品中产气荚膜梭菌数即为85×(8/10)×10000=680000),报告产气荚膜梭状芽胞杆菌数/g(mL) 。


产气荚膜梭菌检验检测程序

↓

检样25g(mL)或稀释液225mL

↓

TSC琼脂混合倾注

↓

黑色菌落记数

↓

任挑黑色菌落10个,分别接种FT培养基

↓

确证试验

↓


镜 动 销 牛 卵

检 力 酸 奶 磷

形 试 盐 发 脂

态 验 还 酵 分

　　原　　解

↓

菌落计数


四、培养过程中芽胞形成和肠毒素的产生:

　　假如对分离的菌株,直接测试芽胞和肠毒素,应在硫乙醇酸盐肉汤中继续培养,如上述,将储存培养物移至其它实验室作测试时,必须先将其移种至Difco公司生产的熟肉培养基中,并于35℃培养24小时,然后再置于室温中24小时,并将此熟肉培养物放置在4℃保存。

　　用旋转混合熟肉培养物,并分别各移种0.5mL至2支含10mL新鲜经杀菌的液体硫乙醇酸盐培养基中,将其中1管置于有水的烧杯中,或在水浴中加热75℃10分钟,于35℃培养18小时,另外1管在35℃培养4小时,并将此培养物接种改良AE芽胞形成培养基中,最好用0.75mL经4小时培养的硫乙醇酸盐的培养基,接种到芽胞肉汤中,于35℃厌氧罐中,培养18-24小时。

　　核对培养结果,用相差显微镜观察芽胞或作涂片染色镜检,显微镜视野中少于5个芽胞的认为芽胞形成不良。

　　将芽胞形成培养物用10000×g转速15分钟离心,并将无细胞的芽胞培养物,以反向乳凝试剂盒,检测肠毒素。

五、控制：

　　适宜的冷却处理和再加热，食品加工人员的教育。 当产品达到合适温度时，那些未被杀死的芽胞可能发芽。蒸煮后需要经过快速统一的冷却，事实上在所有的爆发病例中，产气荚膜梭菌中毒的主要原因是没有经过恰当冷却事先煮好的食品，特别当食品量又是很大时。适当的热处理，充分的再加热，冷却食品，也是必要的控制措施。食品加工人员的教育仍是控制的一个关键方面。