主题：【分享】多功能生物催化剂--卤醇脱卤酶的研究进展

2 卤醇脱卤酶的应用研究
卤醇脱卤酶的催化特性显示这是一类具有广阔 应用前景的多功能生物催化剂。主要体现在催化邻 卤醇与环氧化物之间的转化反应不依赖于辅助因 子;卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行 脱卤反应,而且可以高选择性地催化接受除了卤离 子以外的一系列非自然亲核试剂,如N-3、NO-2、 CN-等所介导的环氧化物开环反应,用以生成一 系列光学纯的β-取代醇[13-14]。尤其在催化CN-介 导的环氧化物开环反应中,不但可以合成一类具有 光学纯的高价值中间体β-羟基腈,而且生成了新 的C―C键。因此,除了已知的转醛酶、转酮酶和 羟基腈裂解酶外,卤醇脱卤酶也可以作为化学合成中的一种工具酶用于C―C键的合成中。
2?1 高选择催化邻卤醇的脱卤反应
卤醇脱卤酶在催化由邻卤醇合成环氧化物方面 具有很高的立体选择性,因而通过动力学拆分可以 直接合成具有光学活性的环氧化物和卤代醇类。其 中光学纯的邻卤代醇是合成光学纯的环氧化物的前 体,环氧化物环具有极其活跃的反应特性,易于和 卤素、碳、氮、氧或硫等亲核试剂反应,因此可以 制备很多相关的衍生物。尤其是具有光学活性的 C3环氧化物及其衍生物,如表氯醇、缩水甘油 2,3-二氯-1-丙醇和3-氯-1,2-丙二醇等,由于它们 都具有甘油的骨架,因而在手性化合物合成方面极 具潜力。例如缩水甘油衍生物与胺的转化是制备多 种β-阻断剂中非常重要的一步[15]。目前,应用单 加氧酶和环氧化物水解酶来合成光学纯的环氧化物 也有相关报道。
来源于放射形土壤杆菌(A?radiobacter)菌 株AD1的卤醇脱卤酶HheC可以高选择性地催化 不同的芳香族邻卤醇的转化,生成相应的R型环 氧化物和S型邻卤醇。动力学分析显示HheC的高 对映体选择性主要取决于酶对不同对映体的绑定和 化学反应步骤。卤醇脱卤酶的这一催化特性也在相 关的X射线的晶体学研究中得到了解释[16]。三级 结构数据显示,对映体(R/S-pNSO)在活性位点 的空间结合位置存在着明显的区别。主要体现在环 氧化物环上的氧原子及β碳原子的位置不同。其中 S对映体以非产物形式结合于其上,即环氧化物上 的氧原子取向错误,以至于无法与催化氨基酸残基 酪氨酸Tyr145形成氢键,亲核试剂无法对β碳原 子进行亲核攻击。因此,只有R构型的对映体才 能转化为相应的β取代的醇。自由能的计算显示二 者之间只有很小的差异,这同R构型结合有两个 氢键而S构型的结合只有一个氢键相一致。 上述研究结果为该酶的改造奠定了良好的理论 基础。可以应用定点突变技术对酶的底物结合口袋 进行改造,来调控HheC的对映体选择性[17]。通 过将该区域的139位酪氨酸突变为较小残基,突变 体HheC完全失去了野生态酶对(R)型对映体的 高选择性。稳态动力学研究表明,这主要是由于突 变体对(S)型底物的亲和力大大提高,而对(R 型底物的亲和力有所降低的缘故。另外,通过对酶 催化反应的限速步进行改造可以大大提高酶的催化 活性。突变体HheC如Y187F和W249F在催化对-硝基-2-溴-1-苯基乙醇(p-nitro-2-bromo-1- phenyl-ethanol)和1,3-二氯丙醇的转化过程中其 活性得以提高。主要是因为增加了卤离子的释放速 度,该步骤为这些底物转化的限速步骤[18]。这些 研究表明定点突变在调控卤醇脱卤酶的活性与对映 体选择性方面是一种值得推广的好方法。 卤醇脱卤酶在选择性催化邻卤醇转化为环氧化 物反应中,由于反应热动力学平衡的存在,使得反 应难以完全进行。闭环反应是否完全进行,主要取 决于底物中卤素取代的类型。对于氯取代的邻卤 醇,平衡更倾向于形成卤醇,并遵循以下顺序 Cl->Br->I-。为了避免由此而造成较低的对映 体过剩值(e?e?),Lutje等[19]通过加入过量的环 氧化物水解酶来提高产物的光学纯度,并获得光 学纯S型2,3-二氯-1-丙醇和2-氯-1,3-苯基乙醇 (e?e?值均大于99%),且E值分别为>100 和73。
2?2 亲核试剂介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶的多功能性主要体现在亲核试剂所 介导的环氧化物开环反应中。Lutje等[14]以对硝基 苯乙烯氧化物为底物的反应中测验了卤醇脱卤酶与 一系列的离子和非离子亲核试剂参与反应的能力, 发现酶可以接受Br-、Cl-、N3-、NO-2和CN- 等阴离子作为亲核试剂,并且具有较高的区域与对 映体选择性。新近研究表明,除了上述亲核试剂, 卤醇脱卤酶还可以接受其余4种阴离子亲核试剂, I-、SCN-、OCN-和HCOO-[20-21]。在环氧化物 开环反应中,卤醇脱卤酶可以高选择性地催化9种 不同的亲核试剂所介导的反应。因此,可以通过动 力学拆分手段制备多种具有光学纯的β-取代醇和 环氧化物,充分显示出卤醇脱卤酶的广阔应用 前景。
2?2?1 环氧化物的叠氮化
最早生物法催化环氧 化物叠氮化反应是由红球菌Rhodococcussp.的酶 粗提液参与完成的[22],其终产物叠氮化醇具有很 低的e?e?值,并且人们对粗提液中真正起催化作 用的酶了解甚少。此外,可以接受N-3作为亲核试 剂的生物酶种类也很少。卤醇脱卤酶可以接受N-3 作为亲核试剂,而且反应表现出极高的立体选择 性[13]。如HheC在催化对-硝基氧化苯乙烯(p- nitro-styreneoxide,pNSO)进行叠氮化反应,其 终产物(R)-1-对-硝基苯基-2-叠氮化乙醇的e?e? 值为96%,同时没有反应的(S)型环氧化物的e?e?值高于99%。除了对-硝基氧化苯乙烯外, HheC对对-氯环氧苯乙烯也显示出极高的立体选 择性(E>200)。对氧化苯乙烯的选择性却一般, 主要是由于后者化学性环氧化物叠氮化反应很快。 通常,化学性环氧化物叠氮化反应是α位的区域选 择,而酶催化的反应显示出了很高的β区域选择 性。因此,化学性环氧化物叠氮化反应的存在,在 某种程度上降低了该反应的立体选择性。
上述动力学拆分的最大不足之处是其最高产量 只能达到50%,而动态动力学拆分则利用了非偏 好对映体可以发生外消旋反应这一特性,可以使最 终产量高达100%。Lutje等[23]正是利用这一特性, 以表溴醇为底物对其叠氮化反应进行了研究。反应 体系中加入一定浓度的溴离子,表溴醇除了可以发 生叠氮化反应外还可以生成1,3-二溴丙醇。由于 HheC对1,3-二溴丙醇闭环反应具有较低的对映体 选择性,而对表溴醇的叠氮化反应具有很高的对应 体选择性,因此,表溴醇可以通过该反应进行外消 旋化。在一定条件下,以表溴醇为底物,通过动态 动力学拆分可以使得e?e?值大于99%的(S)-1- 叠氮基-3-溴-2-丙醇的产量提高到77%。总之,环 氧化物的叠氮化开环反应可以用于合成具光学活性 的叠氮醇,该产物是极具应用价值的生物活性物质 ―――胺醇的直接前体。
2?2?2 环氧化物的亚硝酸化
HheC催化的以 NO-2作为亲核试剂的环氧化物开环反应较上述的 叠氮化反应复杂,主要是由于NO-2的兼性离子特 性,即氧原子和氮原子都可以对环氧化物环上的C原子进行亲核攻击。虽然NO2介导的环氧化物开 环反应同叠氮化反应一样具有较高的区域选择性 (β位进攻为主),仍然可以产生两种取决于亲核试 剂的N/O选择性攻击而得到的异构体产物。其中 产物之一亚硝酸酯在水溶液中尤其在低pH值情况 下极不稳定,很容易水解成相应的二醇,它由亚硝 酸根上氧原子攻击环氧化物环上β碳原子所得;当 氮原子攻击环氧化物环上β碳原子时,产物为硝基 醇(图2)。研究结果显示,野生态HheC在催化 环氧化物亚硝酸化反应中,以氧原子攻击环氧化物 环上β碳为主,因此终产物大部分是二醇[24]。同 叠氮化反应一样,卤醇脱卤酶在催化环氧化物的亚 硝酸化反应中仍然显示出对(R)型环氧化物的立 体偏好性。其对映体选择性的高低主要取决于环氧 化物的结构,当环氧化物为芳香族或具有α,α-双 取代的环氧化物时,卤醇脱卤酶显示出极高的对映 体选择性;当底物为一般的端位脂肪族环氧化物 时,卤醇脱卤酶通常具有较低的对映体选择性。此 外,当以pNSO为反应底物时,通过动力学拆分 不但可以得到对-硝基苯基-1,2-乙二醇(e?e?= 91%),而且得到具有99%e?e?值的(S)-环氧 化物,其产量为48%。因此,从某种意义上讲,卤 醇脱卤酶可以替代环氧化物水解酶进行环氧化物的 制备。
2?2?3 氰化物介导环氧化物开环反应 因其在酶 催化合成中的多功能性,氰根作为亲核试剂进行环 氧化物开环反应显得尤为重要。其产物β-羟基腈是 一种用于合成具有生物学活性化合物的多用途砌块,是高附加值化合物氨基酸、羟基酸、α-羟基醛等的 中间体。日本Nakamura研究组最早报道了从来源 于棒状杆菌(Corynebacteriumsp?)N-1074菌株 中分离得到的卤醇脱卤酶,可以接受CN-作为亲 核试剂催化环氧丁烷开环反应,生成外消旋的β- 羟基戊腈;催化表氯醇开环生成(R)-γ-氯- (R)-β-羟基丁腈[25-26]。后者是用来合成左旋肉碱 (L-carnitine)的中间体,左旋肉碱是一种类氨基 酸,可以有效促使脂肪转化为能量,是减肥药物的 主要成分。

HheC同样可以以氰根作为亲核试剂,催化环 氧化物开环生成β-羟基腈[27]。具有大体积取代基 相对于简单的端位脂肪族环氧化物而言更具对映体 选择性,特别是α,α-双取代的环氧化物的转化。因 此,可以生成用其他方法难以实现的光学纯三级β- 羟基腈[28]。但是该反应的缺点是具有较低的转化 速率,从而制约了其广泛的应用。
为了克服上述限制,蛋白质的理性设计及分子 定向进化技术可以用于酶的改造,从而使其成为理 想的生物催化剂。新近报道的Fox等[29]的工作非 常引人注目。针对卤醇脱卤酶在催化CN-介导的 环氧化物开环反应的低催化活性,他们巧妙地将随 机突变与计算统计方法相结合,成功地对HheC进 行改造,使产物抑制作用得以消除。因而使得该突 变体HheC在氰化物介导的催化过程中催化活性得 到将近4000倍的提高。该研究成果已成功应用于 合成降低胆固醇药物Lipitor 的前体。
2?2?4 环氧化物的氰酸化反应 除了上述的亲核 试剂外,新近研究发现,卤醇脱卤酶HheC还可以 接受OCN-作为亲核试剂[21]。由于环化反应的存 在,最终生成口恶唑烷酮(oxazolidinone)。口恶唑烷 酮是一类非常有价值的用以生产药物中间体及手性 助剂和受体的合成砌块。该类化合物虽然可以通过 化学方法合成,但产量不高。另外,反应需要在含 有机溶剂的溶液中进行,并且只适用于端位烷烃环 氧化物。因而应用化学方法由环氧化物合成口恶唑 烷酮具有很大的局限性。
卤醇脱卤酶HheC催化OCN-介导的环氧化物 开环反应中,由于OCN-具有兼性亲核试剂的特 性,因此,该离子中的N和O都可以对环氧化物 环上的β碳原子进行亲核攻击,生成β-羟基氰酸酯 和β-羟基异氰酸酯两种异构体产物。由于β-羟基 氰酸酯在室温下不稳定,发生异构化生成β-羟基异氰酸酯,而β-羟基异氰酸酯会自发进行环化反 应最终生成5-取代口恶唑烷酮。通过对所生成的产 物进行鉴定,发现终产物只有5-取代口恶唑烷酮, 而不含其他中间产物。卤醇脱卤酶HheC催化 OCN-介导的环氧化物开环反应不但具有较高的对 映体选择性,而且具有较高的区域选择性。因此, 可以用来制备光学醇的5-取代口恶唑烷酮。尤其是 对2,2-双取代的环氧化物,HheC同样显示出较高 的立体选择性。这与以前报道相一致。
2?2?5 其他亲核试剂所介导的环氧化物开环反应
卤醇脱卤酶也可以接受硫氰酸根作为亲核试 剂[20]。在有硫氰酸根和环氧丁烷存在的条件下, 酶促反应的产物中只含有(R)-1-异硫氰酸-2-丁 醇。这表明作为兼性离子的SCN-,只发生硫原子 对环氧化物环上的β碳原子的亲核攻击,且反应具 有很高的对映体选择性。此外,甲酸根也是卤醇脱 卤酶的底物,但与前面几种亲核试剂不同之处是甲 酸根进行亲核攻击的位点是环氧化物环上的α碳原 子,而不是β碳原子。
综合上述研究结果,发现酶对于不同的亲核试 剂具有不同的催化特异性,而被接受的非卤离子的 亲核试剂都是近于线性构型阴离子,这在很大程度 上取决于卤素绑定位点的空间结构,很可能是由于 绑定位点具有隧道样形状。而卤醇脱卤酶对具有双 取代基的环氧化物有较高的对映体选择性。该类环 氧化物的立体化学中心可以描述为大取代基和小取 代基。如果小取代基是甲基时,不管较大取代基是 烷基、苯基或是酯基,卤醇脱卤酶对该类底物都表 现出极高的对映选择率(E>200)。通过分子模拟 发现甲基伸出于由Trp139、Asn176和Thr134形 成的一个较小的空穴内。在此位置上稍为大一些的 基团就会与这些氨基酸发生空间排列上的冲突,因 此S型的对映体不能很好地结合在活性位点。
3 结论与展望
卤醇脱卤酶在催化环氧化物开环反应中,不但 可以接受卤离子作为亲核试剂,还可以接受包括 N-3、NO-2、CN-、OCN-和SCN-等在内的非自 然亲核试剂,且开环反应大多发生在环氧化物环的 β位,因此可以用来合成一些非自然手性化合物 (图3)。这充分展示了卤醇脱卤酶的多功能生物催 化特性,不但可以催化碳卤键的生成和断裂,还可 以催化碳氧键、碳硫键以及碳碳键的生成,并且所生成的产物具有较高的e?e?值和较好的产量。因 此,卤醇脱卤酶可以广泛应用于环氧化物以及β-取 代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成 氨基醇的前体;手性氨基醇在生物制药领域是一类 很重要的化合物,可用来合成多种生物活性物质。 异硫氰酸取代醇和口恶唑烷酮在农用化学试剂、医 药和高分子化学领域中有着广泛应用。

在已知的3类卤醇脱卤酶中,对HheC的研究 最为详细,其具有诸多HheA和HheB所不具有的 特点,如对于氯丙酮的相对高水平的活性,对短链 邻卤醇或环氧化物具有较高的活性及立体选择性 (R型偏好)。在CN-介导的环氧化物开环反应中, 特别是当环氧化物上的手性碳上存在两个取代基的 时候,其手性选择性得以极大的提高。尤其是甲基 作为第二取代基在手性中心的引入极大地增加了手 性选择性(E>200)。因此,卤醇脱卤酶可以用来 生产具有光学纯的叔醇。相似的规律在细菌环氧化 物水解酶中也有发现[30]。HheA和HheB具有中 等对映体选择性,并且环氧化物中取代基的大小对 酶的选择性与活性都有一定的影响。一般是随着取 代基体积的增加,其选择性增加催化活性降低。 HheB在脂肪族环氧化物的开环反应中对映体选择 性较低,但对带有较长侧链或较大取代基的底物呈 现较高的催化活性。3类酶具有各自的催化特色, 可以针对各自特点对酶进行改造,使其充分发挥各 自的优势。这对大大拓宽卤醇脱卤酶的应用范围起 到十分积极重要的推动作用。

很辛苦！支持下！熊猫！继续努力。为我们提供前沿资讯！

感谢楼主。