主题：【资料】牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法

（二）碘量法
方法原理：如果牛奶中含有β-内酰胺酶，β-内酰胺酶分解青霉素后产生的青霉噻唑酸与淀粉竞争游离碘，破坏了碘与淀粉的蓝色复合物，使蓝色变为无色，从而判断牛奶中是否掺有抗生素分解酶。
实验步骤：取1 ml 牛奶于一小试管中，加入不同浓度β-内酰胺酶溶液，加入250 ppm青霉素V钾磷酸盐缓冲液（磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾8.0g，蒸馏水定容至1L，在115℃灭菌30分钟）40 μl，在37℃水浴中放置30分钟，不时摇动，加入1%淀粉溶液500 μl，摇匀，加入碘液(碘化钾20g，碘5g，蒸馏水定容至250ml )20 μl，在37℃水浴中放置2分钟观察结果。同时做空白对照实验。
结果判定：在2分钟内能使蓝色完全消退的为β-内酰胺酶阳性，不消退者为阴性。即蓝色为阴性，白色为阳性。
讨论：碘量法作为快速筛选方法，每次实验均需要阳性和阴性对照；对反应时间等条件要求较严格，否则容易造成误判；不同牛奶样品实验现象差别较大，还需进一步研究。

二、    微生物方法
1  材料
1.1  菌株  藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001购自国家医学菌种保藏管理中心，在营养琼脂上传代培养备用。
1.2  培养基  营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ（低PH）购自陆桥。
1.3  试剂  试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4  主要仪器  牛津杯（外径8mm）
2  方法
2.1  预试验
2.1.1  抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ（含1×108CFU/ml藤黄微球菌）。
2.1.2  生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析
将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面，其中3片纸上滴加20ul不同稀释度的抗生素分解剂（500万U/ml，50万U/ml，5万U/ml），同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.3  青霉素G浓度的选择
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0IU/ml，0.005IU/ml，0.05IU/ml，0.5IU/ml，5IU/ml）青霉素G的生理盐水，37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径，以确定青霉素G使用浓度。
2.1.4  β-内酰胺酶对菌生长的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度（0U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml，50万U/ml，75万U/ml，125万U/ml，250万U/ml）β-内酰胺酶的生理盐水，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
2.1.5  β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶（0U/ml，4U/ml，40U/ml，200U/ml，300U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.6  脱脂奶对实验效果的影响
    使用10%（w/v）脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。
2.1.7  舒巴坦浓度的选择（未完成，实验参数待验证）
有实验表明，在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现，含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈；含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦（0ug/ml，100ug/ml，200ug/ml，400ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈，以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度（～0.5ug/ml）和舒巴坦最高适用浓度（～200ug/ml）确定的基础上，在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶（高于推荐使用浓度100倍）和不同浓度舒巴坦（0ug/ml，25ug/ml，50ug/ml，100ug/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况，以确定舒巴坦最终适用浓度。
2.1.8  脱脂奶中β-内酰胺酶的测定（未完成，实验参数待验证）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
表1
编号    0.5ug/ml青霉素G    400U/mlβ-内酰胺酶    25ug/ml舒巴坦    结果预测
（是否产生抑菌圈）
1    ＋    －    －    有
2    ＋    －    ＋    有
3    ＋    ＋    －    无
4    ＋    ＋    ＋    有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表1），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。

2.1.9  β-内酰胺酶检测限的测定（未完成）
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素、25ug/ml舒巴坦和不同浓度β-内酰胺酶（0.4U/ml，4U/ml，40U/ml，400U/ml）的10%脱脂奶，37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。
2.2  牛奶样品中β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯，在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶（添加成分见表2），37℃培养18-22小时，观察抑菌圈情况。同时做脱脂奶中β-内酰胺酶的测定。
表2
编号    0.5ug/ml青霉素G    400U/mlβ-内酰胺酶    25ug/ml舒巴坦    抑菌圈    与1号比直径差异    结果预测
1    ＋    －    －    有       
2    ＋    －    ＋    有    ≥3mm
≤3mm    含β-内酰胺酶
不含β-内酰胺酶
3    ＋    ＋    －    无       
4    ＋    ＋    ＋    有       
5    －    －    ＋    无       
6    －    －    －    有/无        含抗生素/不含抗生素

3  实验结果与分析
3.1  预实验结果与分析
3.1.1  生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析
   
      第一次实验            10天后第二次实验            青霉素对照
  第一次实验5万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小；50万U/ml抗生素分解剂可以完全分解青霉素，不产生抑菌圈。
  10天后第二次实验50万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素，与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小。
  第一次实验和第二次实验结果比较，抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。

3.1.2  青霉素G浓度的选择
 
    0.5IU/ml青霉素产生抑菌圈约为22mm，符合实验要求。

3.1.3  β-内酰胺酶对菌生长的影响
 
    极高浓度β-内酰胺酶不影响菌生长。

3.1.4  β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
   
      第一次实验结果                      10天后第二次实验结果
    第一次实验中，4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml青霉素，与对照组比较抑菌圈明显减小。
    10天后第二次实验，200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml青霉素，与对照组比较抑菌圈明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。
    通过第一次实验和第二次实验结果比较，说明抗生素分解剂活性下降。

相关的标准好象还没出来吧？

我坚持喝的加了益生菌的酸奶应该是没这问题吧.

国标方法好像要定成微生物法吧！但微生物方法貌似很复杂呀。

原文由 emoc98311 发表:
相关的标准好象还没出来吧？

没有，过几天去学习，有情况告诉你

原文由 biootech001 发表:
国标方法好像要定成微生物法吧！但微生物方法貌似很复杂呀。

国标没有简单的

原文由 fscmj 发表:
我坚持喝的加了益生菌的酸奶应该是没这问题吧.

没有，酸奶都是没有抗生素的、

酸奶是可能没有抗生素，但是很难说哦有没有拮抗剂哦，比如说β-内酰胺酶哦

请问楼主,这些方法还是无法区分内源性β-内酰胺酶和外源性β-内酰胺酶,检测结果还有用吗?

原文由 xyzwz123 发表:
请问楼主,这些方法还是无法区分内源性β-内酰胺酶和外源性β-内酰胺酶,检测结果还有用吗?

我们正在做，有情况及时和你沟通，好吗