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主题：【原创】太阳打西边出来拉

浏览0 回复27 电梯直达
zlzlp2009
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发表于：2009/08/24 18:07:56 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
悬赏金额：20积分 状态： 已解决

各位大侠你们好,前端时间我做实验时候出现一个很奇怪的问题,希望大家帮我解答!
    我用HPLC梯度洗脱测量咖啡酸和阿魏酸的标样(标准的保留时间为8.815min,14.598min).同一浓度里连续进四针样,咖啡酸的保留时间依次为8.682,6.165,3.715,8.665.阿魏酸的保留时间为14.198,13.798,13.123,14.198.这是在同一浓度,同一个瓶子里面取的,只是加样时间温度,流速,压力都没有多大变化,你说怎么保留时间就变化那么大呢?这时候的面积差异不大,相关性不错!R2=0.999.由于碰到这个情况,不清楚:就请教他人,有人说是溶剂问题,有人说是温度问题,有人说是缓冲液问题,有人说是样品问题.
    我就一一排查
    针对溶剂问题,说有气泡,没混合均匀.我就超声波超30MIN.效果可以说当天的还行,保留时间真的变的接近拉,可是第二天保留时间照样相差较大.
    针对温度问题,我是没办法解决.只有早来点把空调开上,让其工作一段时间后再开始跑基线,跑空白,进样.
    针对缓冲液问题,我需要的是PH=5.4的乙酸缓冲液,之前我用的是乙酸和乙酸铵,后来怕乙酸铵分解,就换成乙酸钠,结果也好了一天,可是峰型直接变拉!有矮胖的变成瘦高的.我说是由于流动相问题,无所谓,只要峰重复性好就行.准备第两天大干一场.可是呢,第一针直接没出峰,后来的峰直接梯度洗脱时间外出来,且峰型比较差.
  说到样品的问题,我看文献说阿魏酸见光易分解,就换用棕色瓶配,结果出来就只有一个峰拉,而且面积也不成比例拉!
  你们说说怎么测一个样品,怎么变化系数那么大!一天一个模样,而且尤其是保留时间,怎么变化如此巨大!
    我还是一个新手阿,不要那么打击我阿!我现在都被这实验打击疯拉,忘各位大侠帮忙,避免我成为精神病人拉!
推荐答案：〓猪哥哥〓回复于2009/08/26

请问下这个针与针之间怎么洗脱,我不是很懂?没尝试过.我只是在进针前跑30MIN的基线,后进针时,针与针之间用液体冲洗几遍!这样符合要求嘛???
后面的梯度我也在怀疑,我为什么要用梯度呢?直接用76/24的比例不就好拉,都在那时候出峰呢?可师姐之前这么做的,我也就没管那么多,现在就请教下你为什么呢?

针与针之间用初始流动相比例平衡。
如果后面还有杂质，可以设置梯度冲出，然后再用初始流动相比例平衡
补充答案：

神话回复于2009/08/25



关于梯度需要增加
1、用极性大的走5分钟；
2、改回初始比例；
3、平衡初始比例。

温度是有影响的，有柱温箱的话应该能控制住。

PH值是很重要的，你还是耐心的再看一下有问题没！

色谱柱看用多长时间了，看峰、柱压等。一般问题不大！

实验还可以灵活的自己调节下比例什么的。。。。

david03052120回复于2009/08/25

既然阿魏酸的保留时间为14min。建议你在15min后改变流动相条件为92：8

时间    流速    A  B
0min    1ML/MIN  92  8
6MIN    1ML/MIN  92  8
7MIN    1ML/MIN  76 24
15MIN  1ML/MIN  76 24
16MIN  1ML/MIN  92  8
20MIN  1ML/MIN  STOP

zqy0797回复于2009/08/24

你的仪器有柱温箱吗？
如果没有，漂移就是温度影响的

yxh1026回复于2009/08/24


你的梯度好像有点问题，回到0min的平衡时间是多少啊？

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2009/8/24 19:49:09 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
怎么没人给帮忙解决下,有劳各位大侠拉!
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〓猪哥哥〓
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2009/8/24 20:39:01 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
先别急。
液相碰到不能重复的也是较常见的。
要重现就一定要保持条件重现。包括：色谱柱平衡情况，柱温，流动相准确性、PH精确度等。
你的实验变数确实很大。建议首先更换一根色谱柱来试试；如果不行，更换一台仪器试试。如果上述都没有问题，需要从仪器本身来看。首先需要注意的是你的流动PH值一定要测准了，PH不同，影响是很大的。还有乙酸铵溶剂分解，一定注意密封，且保持温度在20几度左右。梯度因为没有发图，应该问题不大。还有注意的是柱子一定要密封在柱温箱中。最后就是柱子平衡时间长些。同时注意系统压力，可能哪里堵了导致保留时间变化也是可能的。
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2009/8/24 21:16:04 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我不能不急阿,这个标样我已经跑了一礼拜拉,还没解决.
刚才老兄你说的PH,我每次测量时都用PH计矫正,应该问题不大.温度的话,我们只能用恒温箱控制,没有其他好的方法,条件有限.再者梯度的话,我把程序给你看下
时间  流速      A  B
0min  1ML/MIN  92  8
6MIN    1ML/MIN  92  8
7MIN    1ML/MIN  76 24
20MIN  1ML/MIN  STOP
关于其他的,机器,没什么大问题.今天他们用正相的测,测出来的效果不错.柱子的话,我想检测,不知道怎么测量柱效呢?换柱子的话没条件呢!
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2009/8/24 21:51:44 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你的仪器有柱温箱吗？
如果没有，漂移就是温度影响的
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2009/8/24 21:57:37 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我那没有柱温箱,但之前测其他样品的时候保留时间变化不大!
再说温度影响有那么大嘛?
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yxh1026
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2009/8/24 22:02:09 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zlzlp2009 发表:
我不能不急阿,这个标样我已经跑了一礼拜拉,还没解决.
刚才老兄你说的PH,我每次测量时都用PH计矫正,应该问题不大.温度的话,我们只能用恒温箱控制,没有其他好的方法,条件有限.再者梯度的话,我把程序给你看下
时间  流速      A  B
0min  1ML/MIN  92  8
6MIN    1ML/MIN  92  8
7MIN    1ML/MIN  76 24
20MIN  1ML/MIN  STOP
关于其他的,机器,没什么大问题.今天他们用正相的测,测出来的效果不错.柱子的话,我想检测,不知道怎么测量柱效呢?换柱子的话没条件呢!

你的梯度好像有点问题，回到0min的平衡时间是多少啊？
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2009/8/24 22:08:08 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
不是很懂,忘深入解剖下!
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柏坡
hgycook
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2009/8/24 22:31:30 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
找这个原因就是的一点点的排查，在保障其他条件稳定的情况下，逐步做出调整。先看看柱子吧，换根试试，或者再另一台机器上做。
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cattle86
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2009/8/24 23:52:16 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
感觉温度影响还是挺大的，你开空调时，柱子是裸的，人得走动啊，开老门忘关老啊，这些可能也是导致温度有变化的原因，特别是在空调房这种变化应该要大些哈，而且还是夏天个，我们以前做过的样品有的要求要恒温的，有些没要求。要求老的确实走样对温度要求高。我也不晓得你的样品啊，流动相啊这些对温度影响要求高不高个，只是提个醒有可能是这方面的原因，哎液相都是有这么神奇！以后等我们把她的品性摸清楚老要好办些哈，呵呵！
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flyaway
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2009/8/25 4:39:41 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 yxh1026 发表:
原文由 zlzlp2009 发表:
时间  流速      A  B
0min  1ML/MIN  92  8
6MIN    1ML/MIN  92  8
7MIN    1ML/MIN  76 24
20MIN  1ML/MIN  STOP
关于其他的,机器,没什么大问题.今天他们用正相的测,测出来的效果不错.柱子的话,我想检测,不知道怎么测量柱效呢?换柱子的话没条件呢!

你的梯度好像有点问题，回到0min的平衡时间是多少啊？

我也觉得像是梯度设置问题，根本没有平衡
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