主题：【第二届网络原创大赛】浅谈代谢组学研究平台的建立

浅谈代谢组学研究平台建立
    代谢组学是继基因组学、蛋白质组学之后发展起来的又一热门学科，其特点是用系统生物学的角度去观察研究对象，藉此能找出有意义的生物学标志物或者鉴定出某些未知的成分。在这篇文章里，我首先介绍了代谢组学分析的整个流程，这个比较简单，主要涉及仪器软件方面。然后介绍了某种疾病的代谢组学研究的应用，目的是要寻找有意义的生物学比较物。这篇文章介绍了一个未知物的发现过程。虽然最后通过定性发现这个未知物不是具有临床意义的生物标记物，但我通过这个流程熟悉了代谢组学的概貌，在整个实验中运用了统计学的知识，也应用了各种定性手段。
    代谢组学同其他学科一样，不是一个独立的学科，它需要运用到各种学科的知识与技能。比如说后期的数据处理，以及定性时需要运用的各种手段。因此，代谢组学涵盖的内容相当广泛，在我这个初步的研究中也只是涉及到其中的某些内容，还有很多内容做的不是很深入或者没有涉及到。因此，这篇文章就算是抛个砖，目的是给新手们一个形象的认识（注意实验的层次性），也希望一些喜欢潜伏的高手们出来指导指导，提出您宝贵的建议，分享研究中的心得体会！
    这篇文章注重的是代谢组学方法学和思路，本实验报道的是阴性结果，也没有涉及到具体的疾病（文章中用某病代替，请给位版友谅解）。
一  农药高暴露组与农药低暴露组
a)目的：通过代谢组学的方法来区分某病男性和非某病男性的尿液，寻找有意义的生物标志物。
b)研究对象：5位健康男性（农药暴露低）和5位某病男性（农药暴露高）。
c)研究方法：
i.前处理：1ml尿液经15000转/min离心；取上清液经0.2μm的水相膜过滤
ii.仪器：waters UPLC-Q-TOF
iii.数据处理：PCA
d)图示：








二 某病患者尿液代谢组学的研究
1.小样本分析：
a)目的：通过代谢组学的方法来区分某病病人和健康对照的尿液，以此建立人群中某病的非伤害性、灵敏度高、价格低廉的筛查方法，并寻找鉴定某病的特异性生物标志物。
b)研究对象：8位某病患者的尿液； 8位非某病患者的尿液。
c)研究方法：
i.前处理：1ml尿液经15000转/min离心；取上清液经0.2μm的水相膜过滤
ii.UPLC

iii.Q-TOF  ES+

d)MS SCAN图


e)Markerlynx数据分析
初步分析，发现614.7的峰在某病患镇尿液有4人出现，对照组中未发现。首先排除样品间、仪器进样污染的可能，重新处理样品。
2.重复实验：病例样本未变，增加了8个非某病患者的尿样，进样时病例与对照交叉进样，发现重现性很好，8个病例中仍有4位有614.7的峰。所有对照均没有此峰。由此断定，614.7与某病的相关性很大。通过分析，我找到与614.7峰伴随出现的峰。但还没有对614系列峰强度与病程的关系展开分析。也怀疑是由人为原因引起的误差，如用药、取样带入、饮食引起。考虑需要在收样时要注意这些问题。
3.扩大样本量：扩大样本量（26个病例，20个对照）发现病例组中有2/3有614.7的峰，而20个对照都没有此峰。基本确定排除样本污染、偶然性的问题，确定614.7的峰的确是与某病有关。不能确定614.7与用药有关，也不能说明与血尿有关。由此，我考虑614.7是我很有可能是某病的某种标志物。但目前我主要是对某病的其中一种分型进行的分析，是否要对其他的病例类型进行分析。初步分析可能是一种大分子的碎片形成了614.7峰。则扩大扫描范围，欲将分子量扩大到10000。考虑治疗对其是否会产生影响。
4.扩大分子量扫描范围：发现1228.4等系列峰，但没有很高的其他峰。推测1228.4可能是614.7的二聚体或多电荷产物。
5.治疗后样本：收到6位治疗后的样本，之前6位都存在614.7的峰，但治疗后的尿液显示：均没有此峰。考虑可能原因是治疗所用的切除术，使得故治疗后未出现此峰。由此，将对614.7可能作为某种生物标志物，下一步工作是对其进行鉴定。
6.未知物的分离纯化
a)选择TOF中614.7含量很高的样本，以此进行纯化。
b)选择适当的色谱柱：10*250mm，5μm的C18柱。
c)液相分离条件的摸索：起初用纯甲醇和水作为流动相，发现峰拖尾较严重，即加入三氟乙酸，改善了峰形。在12min左右，出现较大的峰，强度很大。
d)分离纯化 ：在12min时根据峰形接收流出液。
e)冷冻干燥
i.发现试管中有多少不一的白色粉末，起初考虑是流动相中的三氟乙酸所致，但通过同时用三氟乙酸的流动相冷冻干燥后发现没有一点粉末，得出所要的粉末是目标物质，而非三氟乙酸。猜测三氟乙酸在冷冻干燥中蒸发掉了。
ii.二次纯化：发现一个很宽的峰，没有其他峰。间接说明第一次纯化的样品纯度较高。
7.未知物的鉴定
a)氨基酸含量的测定：氨基酸分析仪；样品送至某理化测试中心，结果为几乎不含氨基酸。
b)氨基酸的茚酸酮反应（自己做）：40mg/10ml(茚酸酮／水)，取适量冻干粉末。显色反应后发现颜色未改变，反应为阴性。
c)NMR波谱分析（我没有NMR）
i.某大学氢谱
ii.某大学氢谱、碳谱（这个谱图我不是特别理解，还在学习中）
d)质谱峰的分析：
如图，通过对1.52min的峰进行分离纯化，对614.7、360.9、95.6等峰进行MS/MS扫描，获取其碎片信息，并推测其结构组成。通过分析，发现可能含有碘。

1.52min流出峰的质谱图
e)网上数据库检索：发现医院用作某病检查的某种造影剂含有碘，且分子量是613.7，结合质谱分析的结果，由此推测所检测的物质是这种造影剂在体内的代谢产物。

8.解释
a)治疗前后：治疗前做某检查，治疗后不做。故治疗后的样本中未出现614.7的峰。
b)部分患者没有此峰：采样的时间，有的在没有确诊前（可能未做某检查）收样，或在某检查后一段时间收样（造影剂已代谢排出）。
9.继续分析
a)排除614.7及其系列峰的干扰，继续分析。
b)将Markerlynx所分析的数据导入Simca-P分析软件。分析发现某病患者的样本能够和对照样本很好的区分开来。尚可能存在有鉴别意义的点，需要进一步分析。
  这篇文章通过代谢组学研究平台发现了潜在的有意义的物质，最后经多方面的手段进行了定性。通过这次试验发现代谢组学研究的初步阶段，对样品的全面深入了解是非常重要的，要考虑到可能会出现杂质干扰，这个对后期的数据处理非常重要，否则会走不少弯路！其他的目标物质仍在研究中！欢迎提出宝贵的意见！


浅谈代谢组学研究平台的建立