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主题：【求助】发光试剂Ru-NHS标记蛋白问题

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plf0717
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发表于：2009/11/16 10:12:43 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被sunpengwjh设置为精华；
大家好！

请问有人做过Ru(bpy)32+-NHS标记蛋白吗？？？
（Ru(bpy)32+-NHS是合成的发光试剂：三联吡啶钌-琥珀酰亚胺酯，用来标记蛋白质的）

它标记蛋白需要什么样的条件呢？
比如控制多大的蛋白质缓冲体系（PH，浓度等）？？？

先谢谢！
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2009/11/16 19:19:26 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主想怎样标记，是用交联剂么？
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plf0717
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2009/11/16 19:27:05 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 sunpengwjh(sunpengwjh) 发表:
楼主想怎样标记，是用交联剂么？


文献中不需要再用交联剂了，

发光试剂Ru(bpy)32+-NHS是合成的，已经联上交联剂NHS酯了。直接可以标记蛋白上的NH2
但标记过程中需要注意的细节不熟悉，比如标记体系蛋白质缓冲溶剂的浓度和PH，还有反应时间等等问题。
麻烦做过的高手讲一讲，欲学习学习。

先谢谢了！
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sunpengwjh
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2009/11/17 8:03:04 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这些关键的细节一般在文章中都不会给出，如果要做只能自己优化条件，然后上机考察，不知道有没有和你做一个方向的！
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i_am_ling
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2009/11/18 13:34:25 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
pH对蛋白的影响很大！这是个主要因素！
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plf0717
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2009/11/18 17:08:32 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼上的兄弟，请问你一个问题：

标记时，蛋白质所处的缓冲溶液PH是高于该蛋白的等电点合适呢？还是低于该等电点合适？或者调节等于该蛋白等电点呢？

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2009/11/18 18:02:33 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 plf0717(plf0717) 发表:
楼上的兄弟，请问你一个问题：

标记时，蛋白质所处的缓冲溶液PH是高于该蛋白的等电点合适呢？还是低于该等电点合适？或者调节等于该蛋白等电点呢？


你目前选用的vpH比等电点的高还是低？
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viernes
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2009/11/18 19:08:54 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

 
  帮你搜了篇 Pierce的 NHS酯化的荧光素 说明书
  好好看 对你会很有帮助的
  里面protocol 读懂了修改下应该 标记蛋白是很容易的
  此外，在本版发了篇这个专题的贴子，有帮助的话 记得来顶 呵呵

Pierce NHS-Fluorescein.pdf
附件：
Pierce NHS-Fluorescein.pdf
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2009/11/19 8:39:19 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
多谢几位的帮助，

我欲标记AFP(等电点为4.75)，欲用PH为7.8的PBS作为标记缓冲体系，是否可行。
看了viernes给的资料，很有帮助，再次感谢！
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2009/11/22 0:35:12 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 plf0717(plf0717) 发表:
多谢几位的帮助，

我欲标记AFP(等电点为4.75)，欲用PH为7.8的PBS作为标记缓冲体系，是否可行。
看了viernes给的资料，很有帮助，再次感谢！


pH 7.8  应该可以
都是 近中性  没什么不行的

AFP 等电点虽然低一点
在细胞环境内 pH接近5  AFP的U型疏水内核也是部分解离暴露的
但是 它照样有生理活性
注意 离子强度不要太高倒是真的
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毛毛
ludai
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2009/11/22 8:43:47 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
感谢了，十分的需要，老师辛苦了。真的十分的精辟。不错，支持一下。
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