主题：【第二届网络原创大赛参赛作品】NHS酯化的荧光染料标记方法小结

有人问到 NHS化的染料蛋白标记
我有跟帖简单回答


为了更清楚说明 并让更多人了解 NHS活化的荧光探针标记反应
鉴于 荧光分析于毛细管电泳联用的广阔 前景
单独发个主题帖
这大都是我的经验和理解
本人不是有机专业 有关合成方面 说错的地方还请拍砖

NHS化的荧光染料 是指 N-羟基琥珀酰亚胺 酯化的荧光染料标记  即N上的羟基与荧光探针上的羧基酯化反应



这些荧光探针与蛋白或者小分子胺偶联的原理很简单 都是 羧基与胺基反应生成酰胺键
但是 一般的羧酸更倾向于 与胺基形成 铵盐
因此引入个较好的离去基团就可以使羧基活化 促进羧基与胺基的共价键形成
那么琥珀酰就是个很好的离去基团
将荧光探针 用NHS进行酯化后 既可以相对稳定的保存，也可以直接用于与胺基分子的偶联，降低反应动力学壁垒


与蛋白分子 或是 小分子胺 的偶联，原理相同  都是最终NHS基团离去，剩下的活化羧基与蛋白的胺基反应。
在了解了原理的基础上，在进行NHS酯化的荧光探针标记策略上，应当着重注意以下几点：


不用过多考虑蛋白的等电点，但需记住 胺基作为亲核基团的这个反应一般在 弱碱条件（pH=8~9）下进行
！考虑到蛋白的特殊性 配制缓冲液注意需要避免
          1）极端pH  （2）重金属污染 和（3）过大的离子强度 导致的蛋白变性
！考虑到NHS酯化物的活泼程度，NHS化的荧光染料需要现配现加，不宜配制后静置过久。
！考虑到 反应原理 ，选择缓冲液和反应容器 需要严格避免胺基或者氨基污染，避免与蛋白分子竞争反应掉荧光染料。  e.g. 常用缓冲液 有 borate buffer，NaHCO3，磷酸盐等等


此外，还需注意：
              A.一般 的protocol都是针对 抗体的，抗体是比较 坚强的蛋白
              B.虽说暴露在蛋白表面所有的侧链胺基都有可能跟羧基反应 但是 反应动力学最大的还是 Lys的那个长侧链上的e-伯胺基，因此富含lys的蛋白偶联有福啦。
              C.一般来说，反应活性 伯胺＞仲胺
              D.别忘了 缓冲液选择也要考虑荧光探针自身特性，如果荧光探针自己带一个 很兴奋的胺基，那么由于自体的二聚反应，这个探针用于标记可能会效率很低


当然NHS酯化的商品荧光探针有限，
也可以用直接用 带油羧基的荧光探针偶联 蛋白，这时一般考虑使用 NHS EDC活化体系
其原理就是 EDC先与 羧基形成个 不稳定的活化中间体
然后 NHS接力 替代EDC形成 较稳定的 羧基活化体
接下来的 就和上述原理一样了


至于 标记上的蛋白 和未标记探针的蛋白 相互分离
每家公司各有法宝
我用过 BD公司的葡聚糖柱洗脱回收  也用CZE分离过小分子胺的标记产物
其他更先进的方法就要看 论坛各位大神们的功夫啦


附件上传的是  Pierce的NHS化荧光素的protocol
              以及 Dynal beads羧基化表面偶联抗体的protocol


本文的 参考资料 有：
http://en.wikipedia.org/wiki/N-hydroxysuccinimide

Pierce NHS-Fluorescein.pdf
84_143.05_06_Dynabeads_M_270_Carboxylic%20Acid.pdf