主题：【分享】石蜡切片技术实验

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发表于：2009/12/14 15:14:06 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

一、取材与固定
1 准备工作：工具、药品、计划等
2 动物的麻醉：氯仿麻醉
3 解剖取材
4 材料分割：保持样品的完整性与代表性，考虑切片方向，实心组织大小5*5*2mm,空心细长组织10mm长。
5 固定：布温氏固定液固定24h。
6 漂洗：70%乙醇换洗3次，每次20~60min。
7 保存：70%乙醇0~4 ℃ 。

二、脱水、渗透与包埋
1 脱水：85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇，每步30min~60min
2透明：1/2乙醇＋1/2二甲苯→二甲苯→二甲苯，每步30min~60min
3 渗透： 1/2二甲苯＋ ½石蜡→石蜡→石蜡，每步20min~60min，温度62℃
4 包埋：将材料放入盛有石蜡的纸盒中，摆好位置（要考虑下一步的修快与切片方向），在水中冷却5～10min.

三、切片
1 修块用单面刀片在玻璃板上修快使达到以下要求：
（1）一个蜡块含一个材料，蜡块呈正方形或长方形，材料位于蜡块正中央。
（2）材料边缘与蜡块边缘平行，各面要平直，材料边缘与蜡块边缘的距离约3mm。
2 固着将修好块的蜡块用烧热的解剖刀固着在样品台上。
3 切片按以下顺序进行
（1）将样品台固定在切片机样品臂上，使切面竖直；
（2）调切片厚度5～10um；
（3）将切片刀用纱布蘸少许二甲苯擦净后装到切片机上，调刀角15～20，将刀固定好；
（4）调刀距使样品与刀口尽可能靠近；
（5）切片顺时针摇动切片机速度40-60r/min；
（6）将切好的蜡带光面向下用毛笔放到台纸上

贴片
(1)清洗载波片；
(2)加粘片剂，要求薄、匀；
(3)放切片，光面向下；
(4)加水于切片下面；
(5)展片将载波片放于50℃的温台上至切片完全展平；
(6)烤干吸掉多余水，继续放于温台上至水完全干燥；
5 贴标签临时标签，用铅笔写明组号、姓名。

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2009/12/14 15:15:50 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

四、染色
1 脱蜡二甲苯(2)→二甲苯(1)，每步510min；
2 复水 1/2乙醇+1/2二甲苯→100%乙醇(2)→ 100%乙醇(1)→ 85%乙醇→ 70%乙醇→ 50%乙醇→ 30%乙醇→
蒸馏水,每步2min；
3 初染代氏苏木精染色15min；
4 分化 0.1%HCl脱色至变红→0.1%NaOH至变蓝；
5 脱水蒸馏水（3－5s）→ 30%乙醇→ 50%乙醇→70%乙醇→ 85%乙醇,每步2min；
6 复染 0.5%伊红（溶于95%乙醇）染色10~15min；
7 脱水透明95%乙醇(1020s)→100%乙醇(1) →100%乙醇(2)→ 1/2乙醇+1/2二甲苯→二甲苯(1) →二甲苯(2)(≥3min),每步2~3min；
8 封片将材料周围擦干净（注意在擦的过程中材料上的二甲苯必须保证不能干，可随时补加），加1～2滴中性树胶，加盖玻片（需提前洗净擦干备用）；
9 贴标签注明样品名称、染色方法、组号、姓名和日期；
10 镜检检查样品取材、切片及染色情况，熟悉样品为下次样品观察做好准备；
11 干燥平放于展片盘中，于37℃温箱中或自然干燥；
12 预习下次实验：样品的观察，需提前做好预习，并准备纸、铅笔。
五、观察
1 样品观察
• 小白鼠脑；
• 小白鼠心肌；
• 小白鼠肝脏；
• 小白鼠肾脏；
• 小白鼠肺；
• 小白鼠小肠；
• 小白鼠肌肉；
• 小白鼠精巢；
• 小白鼠卵巢等。
2 绘图
• 任选一种样品将结构完整地绘于实验报告上。
3 样品结构显微照片如下：