一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤
对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时,首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径,计算和确定样品的内毒素限值,选择合适的鲎试剂,根据临床规格,计算最大有效稀释倍数,稀释产品,并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。可以采用凝胶法,也可以采用终点法或动态法。当测定结果有争议时,除另有规定外,以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定
一个药品在投放市场前,它是否满足内毒素限值的要求?样品的内毒素含量具体是多少?这些问题不但关注用药安全,还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息,为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程,但其最终目的还是要为控制药品质量服务。因此,在方法建立时,不但要阐明限值的合理性,考虑技术可能达到的限值,同时还要满足相关药品管理法规的要求。
研究人员在建立方法的早期,一般会按照临床建议的最大人用剂量确定一个非正式的限值,这个限值可以根据实验室可以达到的最低检测水平,把限值订的相对比较严格,但往往由于早期的临床剂量会比最终上市的临床剂量高几倍,所以严格的限值,可能会使得正式生产时很多产品不能通过检查,从而造成不必要的浪费;因此参按照法规允许的最高水平,酌情确定样品的限值。
样品内毒素限值的确定一般与临床人体最大给药剂量有关,剂量越大,单位重量或体积的内毒素限值越低。一般按以下公式计算:内毒素限值L=K/M。式中内毒素限值L是以EU/ml、EU/mg或EU/u表示;K为按规定的给药途径,人体每公斤体重每小时最大可耐受的内毒素剂量,以EU/(kg.h)表示,注射剂K=5EU/(kg.h),其中放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg.h),鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg.h)。一般我国人群平均体重按60kg计算,人体对细菌内毒素的最大耐受量为300EU/h;另我国人体的平均体表面积按1.55m2计算,人体每平方米的最大耐受剂量为(300EU/h)/ 1.55m2 =(193EU/h)/ m2 。 M为人体每公斤体重每小时接受的最大给药剂量,以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或u/(kg.h)表示。
内毒素限值计算举例(一):A注射剂的人体最大用量为每小时1.5g,每公斤每小时体重的剂量为1.5g/60kg=0.025g/kg=25mg/kg,内毒素限值L=K/M=(5EU/kg)/( 25mg/kg ) = 0.2EU/mg。在细菌内毒素检查法中,细菌内毒素标准品和鲎试剂常常以EU/ml表示,所以在具体实验中样品的内毒素的限量可以转换为EU/ml的表示方法,可使实验操作计算更为方便。假定产品A的浓度为100mg/ml(或原料药经溶解后的浓度为100mg/ml), 那么,将产品A的限值从EU/mg转变为EU/ml时,内毒素限值L= 0.2 EU/mg 100 mg/ml = 20 EU/ml。
内毒素限值计算举例(二):B注射剂的临床最大用药剂量为1g/m2,规格为50mg/ml,内毒素限值L=(193 EU/ m2)/(1g/m2)=193 EU/g=0.193 EU/mg,转换为EU/ml 表示时,L = 0.193 EU/mg50 mg/ml=9.65EU/ml。
大输液品种的限值一般定为0.5EU/ml,灭菌注射用水则定为0.25EU/ml。内毒素限值没有考虑到几个药物联合用药问题,但一般情况下,药品中内毒素的含量远低于限值,并且药品生产厂家的内控标准严于注册标准,所以药典内毒素限值也被称为最大允许内毒素浓度(Maximum allowable endotoxin concentration)。
2、样品最大有效稀释倍数或最小有效浓度的计算
最大有效稀释倍数(MVD)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下,对产品进行最大倍数的稀释,仍能够进行内毒素限值的检测,此时所允许稀释的最大倍数。 MVD的计算公式为:当被规定的内毒素的限值以体积表示时, MVD=内毒素限值L(EU/ml )/鲎试剂灵敏度(λ);当内毒素的限值以重量或药品的生物活性(EU/mg或EU/u)表示时, MVD=内毒素限值L(EU/mg 或 EU/u)×供试品溶液的浓度C/ 鲎试剂灵敏度(λ)。在凝胶法中, λ=鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml),在浊度法或显色法中, λ=所使用标准曲线上最低点的内毒素浓度(EU/ml)。
最小有效浓度(MVC)是指在所选择的鲎试剂灵敏度条件下,将产品稀释到一定浓度,仍能够进行内毒素限值的检测,此时所允许的最小浓度。计算MVC的一般公式为:MVC=鲎试剂灵敏度(λ)/内毒素限值(L)。对所选定的鲎试剂灵敏度来讲,MVC是一个绝对值;而MVD对特定的产品浓度是特异的,浓度变化时,MVD也会随之发生变化。