主题：【求助】孔雀石绿试剂盒

【经销商】：武汉上成生物科技有限公司

【生产厂家】：

【原理】：孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒是利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有羊抗鼠IgG抗体。检测时，加入特异性的孔雀石绿的抗体，微孔板上的羊抗鼠IgG抗体与其形成复合物；孵育一段时间后，洗板，加入待测孔雀石绿标准品或样品溶液及孔雀石绿辣根过氧化物酶结合物，它们竞争性地与孔雀石绿抗体结合，形成抗原抗体复合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿的浓度与吸收光强度成反比。

【操作步骤】：

    1、样本前处理步骤
    处理任何样本时，都须注意：
  （1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
  （2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

    样本处理步骤：
  1、鱼/虾样品的准备（稀释倍数1.2）
  a) 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品;
  b) 称取2.5g均质好的样品，放入50ml离心管中，加入5ml提取液A(即配液1)搅匀，加入10ml乙腈，用振荡器剧烈振荡5分钟，3000转／分离心 5分钟，把上清倒入50ml离心管中。
  C)加入10mL正己烷，在振荡器上剧烈振荡5分钟，静置或3000转/分离心3分钟分层，去掉上层正己烷层(可用一个10ml注射器吸去大部分正己烷,然后用1ml移液枪把正己烷层去完全)
  d)向该溶液加入1ml提取液B(即配液2)和5ml二氯甲烷，用振荡器振荡5分钟，3000转／分离心3分钟，移去下面的水层(水层是量少的那层,可以用一个10ml注射器接一软管吸去底层的水层)。 在余下的液体中加入2.0克的无水硫酸钠，不时振荡混合，放置 5分钟。移取液体层, 在50℃下，用氮气吹干或旋转蒸发仪蒸干。
  e)加入0.265ml乙腈，在涡旋仪上充分涡旋5分钟(最好用一把200μl的移液器接枪头对近管底壁摩擦吹打以溶解完全)，加入35μl氧化液，涡旋2分钟，放置15分钟，加入100mg中性层析氧化铝，充分涡旋5分钟；
  f) 取上层25μl，加入50μl样本稀释缓冲液，175μl蒸馏水，混合均匀，取50μl作ELISA分析。

  2、水质样品（稀释倍数1.43）
取水样175μl, 加入50μl样本稀释缓冲液, 25μl乙腈，取50μl作ELISA分析。

【操作步骤】：
 
    3、酶联免疫测定程序
  测定前须知：
  1)、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
  2)、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
  3)、在使用中不要让微孔干燥。
  4)、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
  5)、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

  4测定步骤：
  1)、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min以上，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
  2)、加100μl抗体工作液(即配液4)，用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。
  3)、小心揭开盖板膜，弃去孔中液体，并将微孔板剩余残液在吸水纸上拍干。每孔注满洗涤工作液（即配液3），轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复洗涤4次或机洗5次。
  4)、加标准液或样品液50ul到相应的微孔中，然后加50μl酶结合物工作液（即配液5）到微孔板中，用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。取出重复步骤3
  5)、显色剂A和B以1：1充分混合后，加100μl到微孔中，并在37℃下避光反应15分钟。
  6)、加50μl终止液到微孔板中，在酶标仪于450nm处测定OD值。
所测得的标准液和样品吸光度的平均值除以第一个标准液（0标准液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0标准液的百分吸光度值等于100%。

标准液的吸光度值（或样品）
-----------------------------------×100 = %吸光度值
0标准液的吸光度值
    以标准品浓度的以10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含孔雀石绿的量。
        （此标准曲线仅供参考）

5检测方法灵敏度、准确度

    试剂盒灵敏度：0.1ppb
    样本最低检测限：
    鱼/虾样品的检测限为1.0ppb
    鱼/虾等水产品 ………………………1.0ppb
    水样 …………………………………0.1 ppb

    回收率：
    水样/鱼/虾等水产品…………………90±15%

  6  特异性
  与类似物的交叉反应率：
  孔雀石绿 ……………………… 100%
  结晶紫    ……………………… 91%
  隐性孔雀石绿  ………………… 0.4%
  隐性结晶紫  …………………＜0.01%

  7 注意事项
（1）室温过低或试剂及样品没回到室温，会导致所有标
    准的OD值偏低。
（2）在洗板过程中如果出现板孔干燥情况，则会出现标
    准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板拍
    干后应立即进行下一步操作。
（3）每加一种试剂前需要将其摇匀。
（4）终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
（5）不要使用过了有效日期的试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用，以免降低灵敏度。
（6）0标准液的A450nm<0.6时，表示试剂可能变质，请勿使用。
（7）显色剂变蓝，表明已变质，请勿使用。
（8）该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
（9）储存条件：2-8℃保存，切勿冷冻；将不用的酶标板放进原袋中重新密封；酶结合物和显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

    8 贮藏条件及保存期
    贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
    保存期：本试剂盒有效期为12个月。

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