本法系依据过量的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯(AQC)在一定条件下和氨基酸形成稳定的衍生产物(柱前衍生),用高效
液相色谱法测定衍生产物,根据衍生产物的含量计算甘氨酸含量。
照高效
液相色谱法(附录III B)测定
色谱条件和系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为基质的C18反相色谱柱,颗粒度4μm,内径3.9mm,柱长150mm;柱温为37℃;以140mmol/L乙酸钠、17mmol/L三乙胺pH 5.65、1μg/mlEDTA二钠盐为流动相A液,以100%乙腈为流动相B液,以纯水为流动相C液,流速为每分钟1.0ml,梯度洗脱32分钟(见梯度表),检测波长为248nm。甘氨酸与相邻色谱峰之间分离度应≥1.5;拖尾因子(T)为0.95~1.40之间(甘氨酸和α-氨基丁酸峰)。重复性RSD≤2.0%(甘氨酸对照品峰面积测量值)。
内标溶液的制备 精密称取α-氨基丁酸对照品 4.0g, 加超纯水至100ml定容。
对照品溶液的制备 (1)精密称取甘氨酸标准 2.5g加超纯水至100ml定容。(2) 精密量取(1)项氨基酸标准溶液1.0ml,加9.0ml 1.5%磺基水扬酸,混匀静置2小时以上3000rpm离心10分钟,留取上清备用。①分别精密量取上清液50μl、100μl、125μl、150μl、200μl,置10ml容量瓶中,用纯水定容。②分别精密量取①项中各甘氨酸标准溶液0.1 ml,加0.4ml纯水,加内标0.02ml混匀备用。精密量取(2)②项甘氨酸标准溶液10μl放入衍生管中加70μl硼酸缓冲液(pH8~10)涡旋混和并加入20μl AQC衍生剂涡旋混和15秒,备用。供试品溶液的制备 精密量取供试品溶液1.0ml,加9.0ml 1.5%磺基水扬酸,混匀静置2小时以上3000rpm离心10分钟,留取上清备用。(1)精密量取离心上清液1.0ml,置10ml容量瓶中,用纯水定容。(2)精密量取(1)项中供试品溶液0.1 ml,加0.4ml纯水,加内标0.02ml混匀备用。精密量取(2)项供试品溶液10μl放入衍生管中加70μl硼酸缓冲液涡旋混和并加入20μl AQC衍生剂涡旋混和15秒, 备用。
测定法 精密量对照品溶液与供试品溶液,分别注入
液相色谱仪,记录色谱图32分钟。进样量为10μl。按内标法计算。
时间 流速 A液 B液 C液 曲线
分钟 ml/min % % %
起始 1 100 0 0 *
0.5 1 99 1 0 瞬时
18 1 95 5 0 线性
19 1 91 9 0 线性
22 1 83 17 0 线性
25 1 0 60 40 瞬时
28 1 100 0 0 瞬时
32 1 100 0 0 线性
附注: (1)甘氨酸含量测定应采用柱前衍生及内标法,除本法要求外衍生剂也可选用异硫氰酸苯酯(PITC), 邻苯二甲醛(OPA);内标物也可选用正缬氨酸; C18反相色谱柱的颗粒度也可选用5μm或亚二微米。根据
液相色谱系统、C18反相色谱柱规格、衍生剂及内标物的不同可以调整相应的色谱条件。
(2)直线回归相关系数应不低于0.999。
(3)系统适应性中重复性可用其它适宜方法。
(4)本法也适用于血液制品中组氨酸和精氨酸测定,仅对照品改为相应的组氨酸或精氨酸。
是三部药典中的。
问题是三种溶液按照什么比例混合?只有浓度,药典也说得太不清楚了。